高效液相色譜法同時測定二維葡醛內(nèi)酯片中維生素C、維生素B1的含量

李浩然，田芳芳

（1.漯河市藥品檢測檢驗中心，河南 漯河 462008；2.漯河市第二人民醫(yī)院消毒供應中心，河南 漯河462000）

二維葡醛內(nèi)酯片是由葡萄糖醛酸內(nèi)酯、維生素C、維生素B1及輔料組成的復方類藥物，臨床主要用于急慢性肝炎及肝臟中毒的輔助治療。在其質(zhì)量標準[1]中維生素C的含量測定采用滴定分析法，維生素B1含量測定采用高效液相色譜法（HPLC），實驗操作繁瑣費時。我們采用高效液相色譜法同時測定處方中的維生素C、維生素B1的含量，方法簡單、快捷，結(jié)果準確可靠。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010c型全自動高效液相色譜儀（LC solution 1.22 sp1色譜工作站，日本島津）；CPA-225D型電子分析天平（德國賽多利斯）；FE20/EL20型pH計（瑞士梅特勒）。

1.2 試藥

維生素C對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100425-201103）；維生素B1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100390-201505）；二維葡醛內(nèi)酯片（河北東風藥業(yè)，批號：17011301，17011302，17051701）；乙腈（色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent氨基鍵和硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈 0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）（66:34）；檢測波長：249 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品儲備液 分別精密稱取維生素C對照品100 mg，維生素B1對照品 20 mg，置入50 ml量瓶，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 精密吸取混合對照品儲備液5 ml，置入100 ml量瓶，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中含維生素C 0.1 mg、維生素B10.02 mg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取二維葡醛內(nèi)酯片20片，除去糖衣后，精密稱定，置研缽中研細，精密稱取適量（約相當于維生素C 10 mg、維生素B12 mg），置入100 ml量瓶，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 按處方比例精密稱取輔料0.26 g，再按供試品溶液的稀釋方法配制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取2.2項下混合對照品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果輔料對兩種成分含量測定無影響，維生素C和維生素B1分離度符合規(guī)定，說明色譜條件具有良好的專屬性（見圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

取2.2.1項下混合對照品儲備液，分別加流動相稀釋制成每1 ml中含維生素C 0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 mg、維生素B10.08，0.04，0.02，0.01，0.005 mg的系列對照品溶液，照2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，分別繪制標準曲線，回歸方程分別為：維生素C：Y=2.7823×107C1-75 154，r=1.0000；維生素B1：Y=1.8467×107C2-23 408，r=0.9996。

結(jié)果表明維生素C在0.4～0.025 mg/ml，維生素B1在0.08～0.005 mg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取2.2.2項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣5次維生素C峰面積RSD為0.22 %（n=5），維生素B1峰面積RSD為0.37 %（n=5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取二維葡醛內(nèi)酯片（批號：17011301），按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下方法，按外標法以峰面積分別計算維生素C、維生素B1的含量。結(jié)果維生素C含量RSD為 0.24 %，維生素B1含量RSD為0.32 %，表明本法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

按2.2.3項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣，記錄色譜圖，維生素C平均峰面積為2 739 987，RSD為0.59 %（n=6），維生素B1平均峰面積為 330 960，RSD為0.63 %，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 定量限

取2.2.3項下溶液逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以信噪比為S/N=10:1測得定量限。維生素C定量限為5.4 ng/ml，維生素B1定量限為12.8 ng/ml。

2.9 回收率試驗

將對照品按處方量80 %、100 %、120 %和陰對照溶液混合配制模擬樣品共9份，照2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，按外標法分別計算維生素C、維生素B1的回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗（n=9）

2.10 樣品測定

取二維葡醛內(nèi)酯片（批號：17011301，17011302，17051701），分別按2.2.3項下方法制備供試品溶液，每批3份，按2.1項下方法測定，結(jié)果見表2。

3 討論

傳統(tǒng)方法維生素C、維生素B1采用C18色譜柱進行含量測定[2-8]，由于維生素C、維生素B1極性較強，其在C18色譜柱上幾乎不保留，樣品主成分峰、溶劑峰、雜質(zhì)峰很難實現(xiàn)完全分離。本文采用氨基鍵合硅膠作為固定相，用乙腈 0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）（66:34）為流動相，能克服維生素C、維生素B1在C18色譜柱上保留不足的問題，有效地分離樣品及其中的雜質(zhì)峰，且該方法前處理簡單，有良好的回收率，可快速測定樣品中維生素C、維生素B1的含量。用流動相進行含量測定時，增加乙腈的比例，相應地維生素B1的保留時間變長，而維生素C的保留時間縮短，這是由于維生素C和維生素B1酸堿性質(zhì)不同導致，且流動相偏酸性，可能會使固定相帶負電荷的氨基官能團質(zhì)子化，色譜柱使用一段時間后柱效下降，需要用5～10倍含0.5 %～1.0 % NH3的流動相進行活化。

表2 樣品測定結(jié)果