朱仰艷 蘇錦鈺 潘愛芳 何學友 胡紅莉

摘 ?要 ?在調查福建霞浦楊家溪榕楓公園和福州森林公園的楓香樹葉部病害過程中，分離得到了6株形態(tài)特征有差異的炭疽菌，并采用形態(tài)特征與多基因位點系統發(fā)育分析相結合的方法對其進行鑒定。形態(tài)特征包括菌落性狀、分生孢子盤、分生孢子梗及分生孢子等;系統發(fā)育分析包括內轉錄間隔區(qū)（ITS）、β-微管蛋白（TUB2）、肌動蛋白（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和幾丁質合成酶（CHS-1）5個基因。研究明確了這6個菌株可鑒定為炭疽菌的3個種，即膠孢炭疽復合種中的果生炭疽菌C. fructicola和熱帶炭疽菌C. tropicale，以及尖孢炭疽復合種中的松針炭疽菌C. fioriniae。經柯赫氏法則的驗證，這3個炭疽菌種均可引起楓香炭疽病，但致病力有所不同。這也是C. fructicola、C. tropicale和C. fioriniae引起楓香炭疽病的首次報道。

關鍵詞 ?炭疽病;楓香;種類鑒定;系統發(fā)育分析

中圖分類號 ?R379 ? ? ?文獻標識碼 ?A

Abstract ?Six morphologically different Colletotrichum strains were obtained during the investigation of Liquidambar formosana Hance leaf diseases in Fujian. The six strains were identified based on morphology （colony， acervuli， conidiophores and conidia） and multi-loci （ITS， TUB2， ACT， GAPDH and CHS-1） phylogenetic analyses. The six strains belonged to three Colletotrichum species， i.e.， C. fructicola， C. tropicale and C. fioriniae， which belonged to Colletotrichum gloeosporioides complex and Colletotrichum actatum complex， respectively. The results from Kochs postulates supported the three Colletotrichum species could cause leaf anthracnose to Liquidambar formosana， and the pathogenecity of them was different. This is the first report of the three Colletotrichum species to cause leaf anthracnose on Liquidambar formosana.

Keywords ?anthracnose; Liquidambar formosana; identification; phylogenetic analyses

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.014

楓香（Liquidambar formosana Hance）為金縷梅科楓香屬植物，別名楓樹，為落葉喬木，樹干筆直高聳，適應性強，是優(yōu)良的園林觀賞樹種和行道樹種[1]。楓香在生長過程中容易發(fā)生病蟲害，嚴重影響楓香的生長和觀賞價值[2]。

2017年在福建霞浦楊家溪榕楓公園及福州森林公園的楓香葉片上發(fā)現了較為嚴重的葉部病害，導致楓香葉片在變黃或變紅前就凋落，嚴重影響其觀賞價值。我們在調查楓香葉部病害的過程中發(fā)現引起楓香葉部病害的病原菌不止1種，僅炭疽菌屬就分離純化得到了6株形態(tài)特征有差異的菌株。查閱文獻發(fā)現，2000年Lu等[3]在《香港真菌列表》里報道過香港楓香上膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的有性階段圍小叢殼菌（Glomerella cingulata），2018年何學友和潘愛芳[2]在《中國楓香病蟲害》一書中提到的未鑒定到種的炭疽菌屬真菌就是本文中獲得的菌株。

目前國際上通用的炭疽菌屬的分類主要基于形態(tài)特征和多基因序列的系統發(fā)育分析，已確定了14個復合種和15個獨立種[4-5]。有學者也多次報道在同一寄主上分布著不同炭疽菌，比如山茶屬和辣椒上都發(fā)現了多種炭疽菌[6-7]，但國內對楓香上的炭疽菌未見詳細的報道[3]。本研究擬通過分離楓香葉部炭疽病的病原物，對病原物的形態(tài)特征進行觀察和差異比對，結合病原物的致病性實驗以及多基因序列的系統發(fā)育分析的方法，明確楓香葉部炭疽病病原的種類，以期為楓香炭疽病的防治提供參考依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

2017年9月，在福建霞浦楊家溪榕楓公園和福州森林公園（SLGY）采集楓香樹的發(fā)病葉片，可以觀察到2種主要的病斑特征，分別是褐斑及黑斑（圖1），其中褐斑可以在葉片及葉柄（本研究中將葉片基部以下劃分為葉柄）上觀察到，并分別標記為HB及YB，而將黑斑標記為OHB（文中關于菌株的編號均參照此標記）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?病原菌的分離、純化及保存 ?在發(fā)病部位的病健交界處剪取大小約為1.5 mm×1.5 mm左右的葉片，將其放入75%的酒精中浸泡45 s取出，用無菌水沖洗3次，置于滅過菌的濾紙片上，吸干水分后，放入PDA培養(yǎng)基上，并置于26 ℃、光周期為12 h光暗交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察，如有菌絲從葉片組織周圍長出，進行純化，將純化得到的純菌落保存在PDA試管斜面，放置于4 ℃冰箱保存。

將獲得的純菌落用接種針挑取菌絲至PDA培養(yǎng)基上，封口后放于26 ℃，光周期為12 h的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 d后，觀察其菌落形態(tài)并測量記錄其菌落直徑的大小。培養(yǎng)7 d后，觀察其是否產孢。如果產孢，制作臨時水玻片，拿到顯微鏡下觀察產孢結構和分生孢子等形態(tài)特征，并拍照、測量（孢子的長度和寬度）和記錄（每株供試菌株測量30個孢子并求其平均值來確定該供試菌株孢子的大小）。如沒產孢，將菌絲劃斷造成脅迫使其產孢，即用滅過菌的1 mL槍頭在培養(yǎng)基上打孔（4～5個）后，將其放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后，觀察到在孔口周圍有橘黃色的孢子堆產生。此后的觀察方法同上。

1.2.2 ?DNA粗提及PCR擴增 ?DNA提取采用真菌基因組粗提取法（1 mol/L Tris-HCL，pH 8.0，0.5 mol/L EDTA，20% SDS，5 mol/L NaCl），對獲得的DNA進行多基因PCR擴增[ITS（ITS1和ITS4）[8-9]，TUB2（BT2A和BT2B）[10]，ACT（ACT-512F和ACT-783R）[11]，GAPDH（GDF和GDR）[12]，CHS-1（CHS-79F和CHS-345R）[11]]，擴增后取5 ?L PCR產物加至1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，當條帶明亮清晰無雜帶，且條帶大小與所擴基因片段大小相同時，將擴增產物送至博尚公司測序。

在BioEdit[13]中對獲得的序列進行修正，將修正過的序列放入NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）中進行BLAST，得到初步的比對結果。根據已發(fā)表的文獻，從NCBI中選取42個炭疽菌種的序列作為參考序列，加上本研究中獲得的6個菌株的序列（表1），一起用于系統發(fā)育分析。用PhyloSuite[14]進行單基因序列的比對及多基因序列串聯在一起后，分別使用IQ-tree[15]進行最大似然（maximum likelihood，ML）分析及使用MrBayes[16]進行貝葉斯（Bayesian inference，BI）分析，并將獲得的不同系統發(fā)育樹進行拓撲結構比較。最后用Figtree（https：//www. softpedia.com/get/Science-CAD/FigTree-AR.shtml）對系統發(fā)育樹進行注釋。

1.2.3 ?致病性測試 ?為了確認所得菌株的致病性，取楓香的健康幼嫩葉片及成熟葉片（大小及葉片顏色相似）用自來水輕微沖洗后，用草紙吸干;將準備好的葉片放入準備好的培養(yǎng)皿中（皿內放有2張濾紙并已用水潤濕），葉柄用棉花包裹后并將棉花潤濕，培養(yǎng)皿內保持濕潤但無積水;每株供試菌接5點，分別為葉片的3個葉尖、葉中及葉柄，每張葉片3個重復，用10 ?L槍頭對葉片進行輕微造傷后，將打好的菌柄放于造傷處;蓋好蓋子后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d（5 d后有病斑出現）后拍照記錄，實驗重復3次。同時對實驗數據進行方差分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?病原菌形態(tài)鑒定

本研究從感病的楓香葉片及葉柄分離得到6株炭疽菌菌株，其具體形態(tài)特征見圖2和表2。根據菌落的性狀、產孢結構、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征將6個菌株分為3組，即FX HB 2、FX HB SLGY 2、FX YB 3和FX HB 3分為第1組，FX OHB 1 2為第2組，而FX YB SLGY 2為第3組。通過與已知的炭疽菌種進行比較發(fā)現，前2組的形態(tài)特征（分生孢子盤褐色，有時在盤中央可見錐刺狀褐色剛毛;分生孢子無色、單胞、表面光滑、棍棒狀、兩端稍鈍圓）與膠孢炭疽復合種（Colletotrichum gloeosporioides species complex）的形態(tài)特征相似[17]，其中，第1組與果生炭疽菌C. fructicola的描述相符，第2組與熱帶炭疽菌C. tropicale的描述相符[18];第3組的形態(tài)特征（分生孢子無色，單胞，表面光滑，似梭形，兩端稍鈍）與尖孢復合種（Colletotrichum acutatum species complex）松針炭疽菌C. fioriniae的描述相符[19]。

2.2 ?病原菌序列系統發(fā)育分析

單基因序列分析（ACT，CHS-1，GADPH，ITS，TUB2）和多基因序列聯合（5個基因位點串聯）分析得到的系統發(fā)育樹拓撲結構相似，但是多基因序列分析得到的系統發(fā)育樹部分分支的支持率（SH-aLRT≥75%，bootstrap support≥95%）更高。本研究采用多基因序列分析（圖3）。從圖3可以看出，第1組和第2組的菌株分布在膠孢炭疽復合種（Colletot?ri???chum gloeosporioides complex），第1組的菌株與果生炭疽菌C. fructicola聚在一起，支持率分別為97和100;第2組的菌株與熱帶炭疽菌C. trop?icale聚在一起，支持率分別為74%和95%。第3組的菌株與尖孢炭疽復合種（Colletotrichum acu???ta?tum complex）的松針炭疽菌C. fioriniae聚在一起，支持率分別為99%和100%。從上述結果來看，系統發(fā)育分析的結果支持了形態(tài)鑒定。

2.3 ?病原菌致病性測試

3 ?討論

目前國際通用的炭疽菌屬真菌分類鑒定的方法，主要是結合形態(tài)學與分子系統發(fā)育學（多基因位點的系統發(fā)育分析），即比較形態(tài)特征（包括菌落大小、顏色，無性態(tài)與有性態(tài)的產孢結構和孢子形態(tài)特征，以及有無剛毛等）的分類與多基因序列組合分析得到的系統發(fā)育樹的拓撲結構，從而選擇對不同復合種進行系統發(fā)育分析的最適基因位點[17， 20-21]。但對于不同的復合種（species complex），所用的基因位點有所不同，比如：在膠孢炭疽復合種（Colletotrichum gloeosp?orio?ides complex）的研究中運用到了ITS、GAPDH、CAL、ACT、CHS-1、GS、SOD2和TUB2等8個基因位點[17]，在博寧炭疽復合種（Colletotr?i?chu?m boninense complex）的研究中運用到了ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH、HIS3以及CAL等7個基因位點[21]，而對于尖孢炭疽復合種（Colletotrichum acutatum complex）的研究，前人則運用ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH、HIS3等6個基因位點[22]。本文運用了形態(tài)學與多基因序列系統發(fā)育分析相結合的方法，因為對于不同的復合種運用的基因位點既有相同的位點也有不同的位點，并且在本研究中是將膠孢炭疽復合種和尖孢炭疽復合種放在一塊兒分析，所以就選取了ACT、CHS-1、GAPDH、TUB2、ITS等5個基因位點對分離到的6個炭疽菌菌株進行分析，并將引起楓香炭疽病的6個炭疽菌菌株具體鑒定到3個種，即膠孢炭疽復合種（Colletotrichum gloeosporioides complex）的果生炭疽菌C. fructicola和熱帶炭疽菌C. tropicale，以及尖孢炭疽復合種（Colletotrichum acutatum complex）的松針炭疽菌C. fioriniae。這2個復合種的多基因系統發(fā)育分析得到系統發(fā)育樹的拓撲結構跟中國辣椒上炭疽病菌[7]的研究報道相似。這也驗證了本文中系統發(fā)育樹的準確性。

前人多次報道在同一寄主上分布不同炭疽菌，比如山茶屬和辣椒上都發(fā)現了多種炭疽菌，常見的炭疽菌種類包括松針炭疽菌C. fioriniae、果生炭疽菌C. fructicola、膠孢炭疽菌C. gloeosporioides等[6-7]，除此之外，像辣椒炭疽菌Colletotrichum capsici不僅存在于辣椒上，在南瓜上也有發(fā)現[23]。因此有些炭疽菌并不是某些植物上特有的，這說明多種炭疽菌在同一種植物上出現的可能性很大，但有些炭疽菌有寄主偏好性。因為之前鑒定手段的局限性，楓香上只報道過膠孢炭疽菌的有性階段圍小叢殼[3]，本文在此基礎上，進一步對楓香炭疽病的病原菌種類進行了鑒定，首次報道楓香上的3種不同炭疽菌，即果生炭疽菌C. fructicola、熱帶炭疽菌C. tropicale和松針炭疽菌C. fioriniae。雖然同一寄主上有不同的炭疽菌，大部分都可以致病，但不同炭疽菌在同一寄主上的致病性也是有差異的。例如，在對梨屬（Pyrus）植物上的炭疽菌進行研究時，致病性實驗的結果表明，膠孢炭疽復合種、尖孢炭疽復合種和博寧炭疽復合種的炭疽菌在致病性上存在差異，如生炭疽菌C. fructicola對梨的果實和葉片的致病性高于松針炭疽菌C. fioriniae[24]。與本文的研究結果相一致，即對于楓香的葉片及葉柄而言，果生炭疽菌C. fructicola和熱帶炭疽菌C. tropicale引起的病斑比松針炭疽菌C. fioriniae引起的病斑大。

在已報道的研究中，多數病原菌接種實驗都是用孢子懸浮液[24]，對不產孢的菌株，則用菌絲塊接種。本文中使用菌絲塊做致病性實驗，3次重復的結果顯示，對于葉片的接種而言，果生炭疽菌C. fructicola、熱帶炭疽菌C. tropicale和松針炭疽菌C. fioriniae引起的病斑大小差異較小，但是3個種在葉柄上的接種結果差異比較大。為了提高致病性實驗的準確性，在后續(xù)的研究過程中，會找出促進文中3種炭疽菌的最適產孢方式并進行孢子懸浮液接種，從而更好地比較果生炭疽菌C. fructicola、熱帶炭疽菌C. tropicale和松針炭疽菌C. fioriniae 3種炭疽菌的致病力。

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