劉新輝

（深圳市中醫(yī)院腎病科，廣東深圳 518033）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的一種進(jìn)展性微血管并發(fā)癥，可累及腎小球、腎小管、腎血管及腎間質(zhì)。盡管腎小球被認(rèn)為是DKD腎臟損傷的首要靶點，然而越來越多的證據(jù)表明腎小管損傷在DKD進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[1]。目前的觀點認(rèn)為，DKD不僅僅是腎小球硬化的表現(xiàn)，而且是腎小管上皮細(xì)胞對多種信號通路、細(xì)胞因子進(jìn)行整合、“精心策劃”的結(jié)果[2]。腎小管損傷及細(xì)胞凋亡與DKD疾病嚴(yán)重程度具有相關(guān)性[3]。又有研究表明，近端腎小管上皮細(xì)胞是機(jī)體含線粒體最豐富的細(xì)胞之一，其功能的正常與否極大地依賴于線粒體。近端腎小管上皮細(xì)胞線粒體損傷是DKD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[4]。而線粒體自噬是細(xì)胞維持線粒體穩(wěn)態(tài)及功能的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制[5]。其中，同源性磷酸酶張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten induced kinase 1，PINK1）∕帕金蛋白（Parkin）介導(dǎo)的線粒體自噬是目前哺乳動物細(xì)胞中線粒體自噬研究最深入的信號通路，然而其在DKD中的作用還有待闡明。

DKD屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇，與先天稟賦不足、飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞倦太過等密切相關(guān)，其病位在腎，涉及五臟六腑。DKD的病機(jī)特點為本虛標(biāo)實、虛實夾雜。黃芪是中醫(yī)方劑中治療DKD的常用且有效藥物[6，7]。黃芪甲苷（astragalosideⅣ，AS-Ⅳ）是中藥黃芪的主要活性成分，可抗炎、抗氧化、降糖及抗衰老[8]，對糖尿病腎臟有明顯的保護(hù)作用[9，10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可調(diào)控2型糖尿病小鼠（db∕db小鼠）腎臟PINK1∕Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，并發(fā)揮腎保護(hù)作用[11]?；诖耍狙芯繑M進(jìn)一步在體外實驗中探討AS-Ⅳ對高糖（HG）誘導(dǎo)的近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡及線粒體自噬的作用?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，由美國ATCC公司提供。NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清及1%青霉素—鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每1～2 d換液1次。細(xì)胞生長融合至80%～90%時用2.5 g∕L胰蛋白酶（含0.2 g∕L EDTA）溶液消化、傳代，或無血清化用于后續(xù)實驗。

1.2 主要藥物與試劑 AS-Ⅳ（美國Abmole公司，批號：83207-58-3）。D-葡萄糖（美國Sigma-Aldrich公司）；cleaved-caspase-3、PINK1抗體（美國Gene Tex公司）；Parkin、輕鏈-3（light chain 3，LC3）-Ⅱ、LC3-Ⅰ、β-actin抗體（美國Sigma-Aldrich公司）；二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（ESCO公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、全自動凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad Laboratories公司）。

1.4 分組 將NRK-52E細(xì)胞分為3組：正常對照組、HG刺激組、AS-Ⅳ干預(yù)組。正常對照組僅加入普通培養(yǎng)基；HG刺激組加入含葡萄糖濃度為30 mmol∕L的培養(yǎng)基；AS-Ⅳ干預(yù)組加入含葡萄糖濃度為30 mmol∕L的培養(yǎng)基的同時加入AS-Ⅳ100 μmol∕L。刺激時間為48 h。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測 采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）檢測HG及AS-Ⅳ對細(xì)胞增殖能力的影響。將密度為105個∕mL的單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁后按組別給予HG及HG+AS-Ⅳ刺激，每組設(shè)置6個復(fù)孔。48 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度[D（λ）]，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（p∕%）=[對照組D（λ）-實驗組D（λ）]∕[對照組D（λ）-空白組D（λ）]×100%。

1.6 Westernblot法檢測cleaved-caspase-3、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組刺激48 h后吸走培養(yǎng)基，用預(yù)冷的0.01 mol∕L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次。加入1×細(xì)胞裂解液100～150 μL∕皿并覆蓋均勻，置于冰上，搖床上裂解10～15 min。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞蛋白并移入預(yù)冷的1.5 mL EP管中，離心（4℃，12 000 g，10 min）后將上清轉(zhuǎn)入另一1.5 mL EP管。采用Bradford法測蛋白濃度并配平。將等量的蛋白樣本加入孔槽中，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5 g∕L脫脂奶粉室溫封閉60 min；孵育一 抗（cleaved-caspase-3、PINK1、Parkin、LC3-II、LC3-I、β-actin）、二抗，曝光顯影，圖像分析。采用Image-Lab軟件（美國Bio-Rad公司）進(jìn)行電泳條帶灰度值分析，其結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值（p）表示。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，每項實驗至少重復(fù)3次。多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并進(jìn)行兩兩比較，方差齊時采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NRK-52E細(xì)胞增殖能力比較 圖1結(jié)果顯示：HG刺激組NRK-52E細(xì)胞增殖受到顯著抑制（P＜0.01），AS-Ⅳ干預(yù)可有效緩解HG對細(xì)胞增殖的抑制作用（P＜0.01）。

圖1 各組NRK-52E細(xì)胞增殖能力比較Figure 1 Comparison of the proliferation ability of NRK-52E cells

2.2 各組NRK-52E細(xì)胞促凋亡蛋白表達(dá)比較 圖2結(jié)果顯示：HG刺激可顯著上調(diào)NRK-52E細(xì)胞促凋亡蛋白cleaved-caspase-3的表達(dá)（P＜0.01），而HG+AS-Ⅳ組cleaved-caspase-3的表達(dá)被顯著下調(diào)（P＜0.05）。提示AS-Ⅳ可抑制HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡。

2.3 各組細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 圖3-a結(jié)果顯示，HG刺激組細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達(dá)均升高，而HG+AS-IV組以上指標(biāo)均有所下降。對灰度值進(jìn)行半定量分析（見圖3-b、c、d）顯示，HG刺激組PINK1、Parkin相對表達(dá)量及LC3-Ⅱ∕LC3-Ⅰ比值顯著升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；HG+AS-Ⅳ組PINK1、Parkin相對表達(dá)量及LC3-Ⅱ∕LC3-Ⅰ比值顯著降低，與HG刺激組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。提示HG可促進(jìn)NRK-52E細(xì)胞線粒體自噬，而經(jīng)AS-Ⅳ干預(yù)后其自噬現(xiàn)象有所緩解。

圖2 各組NRK-52E細(xì)胞cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)比較Figure 2 Comparison of the expression levels of cleaved-caspase-3 protein in NRK-52E cells of various groups

3 討論

既往有研究表明，高糖環(huán)境可多途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腎臟小管間質(zhì)纖維化改變[12]。本研究采用高糖（HG）刺激近端腎小管上皮細(xì)胞的方法，在體外模擬DKD的形成，并探討AS-Ⅳ抗凋亡的可能機(jī)制，結(jié)果表明30 mmol∕L HG刺激NRK-52E細(xì)胞48 h可以上調(diào)促凋亡蛋白cleaved-caspase-3的表達(dá)，而AS-Ⅳ干預(yù)可抑制HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡。結(jié)果與文獻(xiàn)[13]研究結(jié)果一致。

近年來，近端腎小管上皮細(xì)胞線粒體損傷在DKD中的作用受到重視。HG狀態(tài)下的線粒體損傷包括線粒體分裂增多、融合減少導(dǎo)致的線粒體片段化改變、線粒體DNA氧化性損傷、線粒體膜通透性增加等。這些因素可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等，從而導(dǎo)致DKD的發(fā)生發(fā)展[14，15]。從來自臨床患者的資料發(fā)現(xiàn)，無論是尿液代謝組學(xué)還是外周血單個核細(xì)胞分析結(jié)果，均表明DKD患者線粒體代謝功能是下降的[16，17]，這進(jìn)一步證實了線粒體損傷在DKD中的重要性。線粒體并不是靜止的細(xì)胞器，而是處于一系列動態(tài)變化中，包括生物發(fā)生、分裂∕融合及線粒體自噬等。當(dāng)線粒體受到損傷后，持續(xù)去極化的線粒體將通過線粒體自噬途徑降解，防止受損線粒體積聚影響細(xì)胞功能[18]。然而，過度的線粒體自噬將清除過多的線粒體成分，同樣會導(dǎo)致線粒體功能障礙影響細(xì)胞功能。因此，線粒體自噬是雙刃劍，既可促進(jìn)細(xì)胞生存，也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是線粒體質(zhì)量調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖3 各組NRK-52E細(xì)胞PINK1、Parkin、LC3-I、LC-3II蛋白表達(dá)比較Figure 3 Comparison of the expression levels of PINK1，Parkin，LC3-I and LC-3II proteins in NRK-52E cells of various groups

PINK1∕Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前哺乳動物細(xì)胞中線粒體自噬研究較深入的信號通路。PINK1是一種包含線粒體定位序列的絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶。正常情況下，PINK1在線粒體膜上經(jīng)過兩次裂解后從線粒體解離并快速降解。當(dāng)各種因素引起線粒體膜電位下降時，PINK1在線粒體的裂解受到抑制，使得大量PINK1積聚在線粒體外膜。PINK1在線粒體外膜的積聚將誘導(dǎo)具有E3泛素連接酶活性的Parkin由胞漿移位到損傷的線粒體，使線粒體外膜的特異性底物蛋白泛素化并募集p62蛋白，進(jìn)而與自噬蛋白LC3結(jié)合，胞漿型LC3（即LC3-Ⅰ）被脂質(zhì)化為（自噬體）膜型LC3（即LC3-Ⅱ），介導(dǎo)泛素化的底物進(jìn)入自噬體，啟動線粒體自噬以清除受損線粒體[19]。LC3-Ⅱ∕LC3-Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低。Smith M A等[20]發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)1型糖尿病4周后大鼠腎臟皮質(zhì)PINK1蛋白表達(dá)增加，而Zhan M等[21]研究發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)1型糖尿病8周后小鼠腎小管上皮細(xì)胞PINK1表達(dá)減少。本課題組前期研究采用2型糖尿病小鼠模型（db∕db小鼠），提取腎臟皮質(zhì)線粒體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與正常對照組（db∕m小鼠）比較，db∕db小鼠腎臟線粒體PINK1、Parkin蛋白表達(dá)顯著增加[11]。而本研究結(jié)果亦顯示，HG刺激可誘導(dǎo)體外腎小管上皮細(xì)胞PINK1、Parkin表達(dá)水平及LC3-Ⅱ∕LC3-Ⅰ比值增加。AS-Ⅳ可下調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。該結(jié)果與本課題組前期體內(nèi)研究結(jié)果一致，從體外研究角度再次驗證了AS-Ⅳ對DKD的治療作用可能與調(diào)控線粒體自噬有關(guān)。

綜上所述，AS-IV可抑制HG誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕線粒體自噬，為其治療DKD提供新的證據(jù)及可能靶點。但本研究僅觀察了線粒體自噬及凋亡相關(guān)幾種蛋白的表達(dá)，下一步擬通過siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒下調(diào)或上調(diào)線粒體自噬，進(jìn)一步探討AS-Ⅳ對腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。