蔡汝健，蔣智勇，勾紅潮，楚品品，李 艷，宋 帥，徐志宏，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640）

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，臨床上以母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎、死胎、弱仔等繁殖障礙，及各種年齡豬呼吸困難和仔豬高死亡率為特征[1-6]。自20 世紀(jì)90年代以來(lái)，PRRS給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。因此，研究疫苗免疫效果對(duì)PRRS的防控具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】1996年我國(guó)報(bào)道了首例PRRSV。PRRSV不斷演變，目前流行的PRRSV存在多樣性和廣泛重組現(xiàn)象，不同地方（區(qū)域）的流行毒株也存在多樣性，使得現(xiàn)有疫苗的保護(hù)力不足，增加了該病的防控難度[7-9]。疫苗免疫是傳染病防控的有效手段之一，PRRS疫苗分為滅活苗（KV）和弱毒苗（MLV）兩類(lèi)。PRRSV-MLV疫苗能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[10-14]，但在安全性和對(duì)異源毒株交叉保護(hù)方面令人擔(dān)憂(yōu)[15-16]；PRRS-KV疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危險(xiǎn)、便于貯存和運(yùn)輸、對(duì)母源抗體的干擾作用不敏感等優(yōu)點(diǎn)，但保護(hù)效果不確切[17-19]。養(yǎng)殖場(chǎng)疫苗選擇多樣，免疫程序也存在較大差異，導(dǎo)致免疫效果不佳，為PRRS防控工作帶來(lái)更大的風(fēng)險(xiǎn)與挑戰(zhàn)。

【本研究切入點(diǎn)】本研究在田間條件下采用4種PRRSV疫苗組合免疫仔豬，通過(guò)免疫日齡和不同疫苗類(lèi)別的免疫方案，統(tǒng)計(jì)和分析PRRSV疫苗免疫效果，以期為養(yǎng)殖場(chǎng)提供和制定合理的免疫程序?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)免疫后的抗體反應(yīng)、病毒血癥和生產(chǎn)參數(shù)評(píng)估PRRS疫苗免疫效果，篩選出PRRS疫苗最佳免疫方案，為PRRS防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)豬場(chǎng)概況 A、B、C 3個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)，規(guī)模分別為760、868、835頭基礎(chǔ)母豬。3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)保育仔豬在30～50日齡時(shí)表現(xiàn)喘氣、呼吸困難、體溫升高、咳嗽、消瘦、毛松，保育仔豬發(fā)病率分別為100%、20%和30%。采集部分發(fā)病仔豬肺、淋巴結(jié)，RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV核酸為陽(yáng)性。3個(gè)豬場(chǎng)的疫苗免疫和發(fā)病情況見(jiàn)表1。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選取 A、B、C 3個(gè)PRRSV陽(yáng)性場(chǎng)，每個(gè)場(chǎng)200頭仔豬，14日齡首免前采血檢測(cè)，PRRSV核酸均為陰性。

表1 試驗(yàn)豬場(chǎng)保育仔豬疫苗免疫和發(fā)病情況Table 1 Vaccine immunization and morbidity in piglets

1.1.3 試驗(yàn)疫苗 A、B、C 3個(gè)豬場(chǎng)分別采用CH-1R株、TJM-92株、VR-2332株不同PRRSV弱毒疫苗和HP-PRRSV滅活疫苗（NVDC-JXA1株），供試PRRSV疫苗均購(gòu)自廣州市生牧生物科技有限公司，疫苗信息如表2所示。

表2 供試PRRSV疫苗信息Table 2 Information of PRRSV vaccines for trials

1.1.4 主要試劑 Rapure Viral RNA/DNA Kits 購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司；一步法RT-PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自廣州英偉創(chuàng)津有限公司；滅菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自廣州市華粵行儀器有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)試劑盒（HerdChekPRRSX3, IDEXX Laboratories Inc., West brook, ME, USA）購(gòu)自美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬群分組及免疫 3個(gè)PRRSV陽(yáng)性場(chǎng)，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)200頭仔豬，隨機(jī)分成4組，每組50頭。按照免疫方案，第1組于14日齡同時(shí)免疫弱毒苗MLV+滅活KV（包括A1、B1、C1）；第2組于14日齡免疫M(jìn)LV+35日齡免疫KV（包括A2、B2、C2）；第3組于14日齡、35日齡免疫M(jìn)LV（包括A3、B3、C3）；第4組于14日齡免疫M(jìn)LV（包括A4、B4、C4）。試驗(yàn)動(dòng)物分組及疫苗免疫方案如表3所示。

表3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及疫苗免疫方案Table 3 Immune program and experimental animal groups

1.2.2 抗體檢測(cè) 免疫前0 d（14日齡）、二免后30 d（65日齡）對(duì)仔豬經(jīng)前腔靜脈采血，編號(hào)，3 000 r/min離心10 min分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。按照PRRSV抗體ELISA試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)對(duì)待檢血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 血清中PRRSV核酸檢測(cè) 利用RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)血清中PRRSV核酸進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)Rapure Viral RNA/DNA Kits試劑盒說(shuō)明提取核酸。一步法RT-PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PrimeScript 1step Enzyme Mix 4 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，模板4 μL，Buffer 25 μL，無(wú)RNA酶H2O 15 μL 。反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30 min；72℃ 1 min；94℃預(yù)變性 2 min、94℃ 50 s、54℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL RT-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ mL溴化乙錠）電脈，最后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.4 生產(chǎn)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)過(guò)程中患有呼吸疾病仔豬頭數(shù)、仔豬發(fā)病率和仔豬死淘率3個(gè)生產(chǎn)參數(shù)，對(duì)比分析各組合免疫效果。利用Graph Pad Prism 5軟件中的Unpaired Student’s t-test方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫PRRS疫苗前后抗體檢測(cè)結(jié)果

從表4可以看出，免疫前0 d（14日齡）抗體視為母源抗體。A、B、C養(yǎng)殖場(chǎng)免疫前0 d（14日齡）的平均抗體水平S/P值分別為1.4、0.995和1.32。二免后30 d（65日齡）仔豬抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，A養(yǎng)殖場(chǎng)A2組抗體最高，S/P值達(dá)到2.5，但與A1、A3、A4抗體水平無(wú)顯著差異；B養(yǎng)殖場(chǎng)：B3組抗體最高，S/P值達(dá)到2.63，但與B1、B2、B4抗體水平無(wú)顯著差異；C養(yǎng)殖場(chǎng)C3組抗體最高，S/P值達(dá)到2.99，但與C1、C2、C4抗體水平無(wú)顯著差異。

表4 免疫PRRS疫苗前后抗體變化Table 4 Antibody changes before and after immunization with PRRS vaccine

2.2 不同疫苗組合試驗(yàn)豬血清PRRSV核酸檢測(cè)結(jié)果

豬血清中PRRSV核酸檢測(cè)結(jié)果（表5）顯示，A1～A4 組PRRSV核酸陽(yáng)性率分別為16%（8/49）、12.5%（6/48）、18%（8/44）和33%（15/45）；B1～B4組PRRSV核酸陽(yáng)性率分別為10.6%（5/47）、0（0/48）、0（0/45）和13.6%（6/44）；C1～C4組PRRSV核酸陽(yáng)性率分別為6.3%（3/47）、8.5%（4/47）、10.8%（5/46）和18.1%（8/44）。

比較分析3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)PRRSV核酸檢測(cè)結(jié)果，第4組PRRSV核酸陽(yáng)性率（A4=33%、B4=13.6%、C4=18.1%）與第1組PRRSV核酸陽(yáng)性率（A1=16%、B1=10.6%、C1=6.3%）無(wú)顯著差異，與第2組PRRSV核酸陽(yáng)性率（A2=12.5、B2=0、C2=10.6%）有顯著差異，與第3組PRRSV核酸陽(yáng)性率（A3=18%、B3=0、C3=10.8%）也有顯著差異。第1、2、3組PRRSV核酸陽(yáng)性率兩兩分析無(wú)顯著差異。

表5 不同疫苗組合試驗(yàn)豬血清PRRSV核酸檢測(cè)結(jié)果Table 5 Detection results of PRRSV nucleic acid in pig serum in different vaccination groups

2.3 不同疫苗組合試驗(yàn)豬生產(chǎn)參數(shù)比較

3個(gè)豬場(chǎng)4個(gè)不同免疫組合患呼吸道疾病仔豬頭數(shù)分別為11、15、26、65頭，發(fā)病率分別為7.3%、10%、17.3%和43.3%，仔豬死淘率分別為4.67%、4.67%、8.67%和11.33%。

3 討論

目前我國(guó)市場(chǎng)上PRRS商品化疫苗在一定程度上對(duì)控制PRRS的傳播和蔓延作出了貢獻(xiàn)[20-23]。但由于PRRSV的生物性、抗原性和基因遺傳多樣性[24-27]，使得不同毒株之間抗原的交叉保護(hù)有限，因此來(lái)源于某一分離毒株制備的疫苗不可能有效地保護(hù)豬群對(duì)抗具有抗原差異的PRRSV所有野毒株的感染[28-30]。因此，生產(chǎn)上常見(jiàn)免疫疫苗的豬群發(fā)生非典型和急性PRRS 病例。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的PRRS疫苗以及制定合理的免疫方案迫在眉睫[31-35]。

本研究為了探討PRRS疫苗在PRRSV陽(yáng)性場(chǎng)的免疫效果，選取3個(gè)PRRSV陽(yáng)性場(chǎng)，采用不同疫苗毒株、不同疫苗組合（同時(shí)接種PRRS弱毒苗+滅活苗、先接種弱毒苗后接種滅活苗、先后接種兩次弱毒苗、接種一次弱毒苗 4個(gè)組合）的免疫方案，通過(guò)對(duì)免疫后抗體水平變化、病毒血癥和生產(chǎn)參數(shù)等方面評(píng)估疫苗免疫效果。

在當(dāng)前PRRSV感染狀態(tài)下，與單一疫苗免疫組合（14日齡免疫弱毒苗）相比，兩針免疫組合（14日齡同時(shí)免疫PRRS弱毒苗和滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫弱毒苗）能夠產(chǎn)生更高的抗體反應(yīng)。在病毒血癥方面，與單一疫苗免疫組合（14日齡免疫弱毒苗）相比，兩針免疫組合（14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫弱毒苗）PRRSV核酸陽(yáng)性率顯著降低。在生產(chǎn)參數(shù)方面，與單一疫苗免疫組合（14日齡免疫弱毒苗）相比，兩針免疫組合（14日齡同時(shí)免疫PRRS弱毒苗和滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫弱毒苗）仔豬發(fā)病率、仔豬死淘率、呼吸道疾病的仔豬頭數(shù)明顯降低。

4 結(jié)論

本研究在3個(gè)PRRSV陽(yáng)性豬場(chǎng)采用4種不同PRRS疫苗組合，通過(guò)對(duì)免疫后抗體水平變化規(guī)律、病毒血癥和生產(chǎn)參數(shù)等方面評(píng)估疫苗免疫效果，結(jié)果表明， 14日齡同時(shí)免疫PRRS弱毒苗和滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗兩種免疫組合的免疫效果最好。這兩種免疫組合可以為PRRSV陽(yáng)性豬場(chǎng)的PRRS防控提供參考。