白菜類作物開花時間相關(guān)基因CCA1的克隆及功能標(biāo)記開發(fā)

劉東讓 侯喜林 肖棟

摘要：以1年生的油用型品種Yellow sarson（YS-143）與2年生的蕪菁品種Vegetable turnip（VT-044）的cDNA為模板，克隆出CCA1基因cDNA全長序列，分析其核苷酸多態(tài)性。在這2份材料構(gòu)建的200株F2分離群體中，選取極早和極晚開花的單株各24株，對在親本上鑒定到的4個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Pearson相關(guān)性分析研究基因型與開花時間表現(xiàn)型的關(guān)系。構(gòu)建pEZS-NL-CCA1載體，利用亞細(xì)胞定位技術(shù)，分析CCA1基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。序列分析表明，YS-143與VT-044分別有1 665、1 647個核苷酸，分別編碼了554、548個氨基酸。親本之間核苷酸序列分析鑒定到12個差異位點(diǎn)，氨基酸同源進(jìn)化樹分析表明，十字花科的不結(jié)球白菜、大白菜、蘿卜、油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F2分離群體上，Pearson相關(guān)性鑒定到位于親本第727至第732個堿基處的1個多態(tài)性位點(diǎn)（ACCCTT/ACCCTT），有該位點(diǎn)的群體單株平均開花時間為39 d，極顯著早于缺失該位點(diǎn)的群體單株平均開花時間104 d（P<0.01），表明白菜類作物CCA1基因的第727至第732個堿基的缺失（A05：472204-472209）與開花時間呈極顯著相關(guān)，影響開花時間，可為光周期敏感的白菜類作物晚抽薹育種研究提供一定的理論依據(jù)。開發(fā)的該Insert/Delete（InDel）標(biāo)記，可以作為功能分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作，以加快育種進(jìn)程。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，CCA1基因主要在細(xì)胞核上表達(dá)。

關(guān)鍵詞：白菜類作物;開花時間;CCA1;InDel標(biāo)記;亞細(xì)胞定位

中圖分類號： S634.01?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0084-07

白菜類作物（Brassica rapa）屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica），是我國乃至世界范圍內(nèi)重要的蔬菜和油料作物，主要包括大白菜、小白菜、蕪菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多種類型[1]。油用白菜類作物包括春性和冬性歐洲生態(tài)類型、我國特有的白菜型油菜和印度的Sarson類型，以根莖膨大為主要特征的蕪菁類型是較原始的白菜類作物栽培種[2]。白菜類作物在開花習(xí)性上有1年生和2年生之分，在抽薹、開花時間上存在很大的差異。因此，白菜類作物是研究抽薹、開花變異、育種和遺傳的良好體系[3]。

開花時間是白菜類作物生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝性狀，是其從營養(yǎng)生長到生殖生長的重要標(biāo)志，先抽薹、開花的現(xiàn)象直接影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。開花時間是由其內(nèi)源發(fā)育信號和多種環(huán)境因素共同調(diào)控的，其中環(huán)境溫度和光周期是主要影響因子[6]。Nelson等對起源于歐洲和澳大利亞的1年生夏季甘藍(lán)型油菜進(jìn)行了光周期敏感性觀察，同時對不同光周期（長日照、短日照）條件下的131份雙單倍體（double haploid）群進(jìn)行了開花時間（天數(shù)）和開花時葉片數(shù)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該親本及群體開花時間受光周期影響[7]。Huang等的研究表明，植物開花的光周期調(diào)控途徑涉及復(fù)雜的晝夜節(jié)律（生物鐘）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，晝夜節(jié)律（生物鐘）核心振蕩子包括CCA1和LATEELONGATEDHYPOCOTYL（LHY）等MYB類轉(zhuǎn)錄因子[8]。在擬南芥中，CCA1基因通過與TIMING OF CABEXP RESSION 1（TOC1）和LHY基因相互作用形成一個生物鐘的反饋環(huán)，即CCA1和LHY基因表達(dá)達(dá)到一定量會抑制TOC1基因的表達(dá)，而TOC1基因表達(dá)量升高則會促進(jìn)CCA1和LHY基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物對晝夜變化做出響應(yīng)，是維持生物鐘節(jié)律的必需組分[9-11]。研究者已經(jīng)在蕓薹屬的多種類型中測序發(fā)現(xiàn)，CCA1存在多個多態(tài)性位點(diǎn)，表明CCA1序列變異可用于開發(fā)與育種性狀相關(guān)的分子標(biāo)記[12]。張志剛等利用CCA1基因在2個敏感性不同的大白菜品種上第329 bp（第4外顯子）處和第1 407 bp（第7外顯子）處的2段序列差異開發(fā)出2個InDel標(biāo)記，用于區(qū)分2個大白菜品種的耐抽薹性[13]。Yi等對3個蕪菁自交系（RCBr、Kenshin 和Chiifu）的DNA序列進(jìn)行分析，在CCA1基因第4內(nèi)含子上開發(fā)出1個InDel標(biāo)記[12]。白菜類作物種類繁多，僅在大白菜和蕪菁上進(jìn)行克隆序列的比較和標(biāo)記的開發(fā)具有一定局限性，而且一般認(rèn)為外顯子上的變異比內(nèi)含子上的變異更有可能影響植物的表型。在我國春季及高寒地區(qū)的秋冬白菜類作物生產(chǎn)中，先期抽薹、開花常常成為降低蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要難題[1]。因此，選育耐抽薹、晚開花的優(yōu)質(zhì)新品種，已經(jīng)成為白菜類作物育種中的重要目標(biāo)，開發(fā)白菜類作物不同類型CCA1基因的分子標(biāo)記，可為分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論依據(jù)[14]。

本研究選用早開花的油用型品種YS-143與晚開花的蕪菁品種VT-044為試材，分別觀察其在長日照和短日照2個條件下的開花時間，同時以這2個材料為模板克隆CCA1基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對其氨基酸序列進(jìn)行分析，開發(fā)出1個InDel標(biāo)記，最后通過驗(yàn)證，將其作為功能標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作，同時利用亞細(xì)胞定位技術(shù)鑒定了CCA1基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

以白菜類作物中純合的1年生油用型品種YS-143（B. rapa L. ssp. oleifera）和2年生蕪菁品種VT-044（B. rapa L. em. Metzg. ssp. rapa）及它們構(gòu)建的F2分離群體為試材。親本用于不同光周期對開花時間的敏感性觀察及鑒定多態(tài)性差異位點(diǎn)，F(xiàn)2代分離群體用于多態(tài)性差異位點(diǎn)的驗(yàn)證。

RNAsimple Total RNA Kit試劑盒、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，購自TaKaRa公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen公司;pEAZY-Blunt載體及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;高保真酶MIX（Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix）購自江蘇南京擎科生物科技有限公司;JS-3000全自動凝膠成像分析儀，購自上海培清科技有限公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?光周期敏感試驗(yàn)?2017年8月3號，將親本材料種子20粒分別在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿里催芽，25 ℃暗培養(yǎng)36 h后播種在穴盤里，分別置于長日照（光照16 h/黑暗8 h）、短日照（光照8 h/黑暗16 h），溫度22 ℃/18 ℃，相對濕度70%，光照度72 μmol/（m2·s）的光培箱中生長，1個月后定植花盆（17 cm）。同時，將F2代分離群體200株也播種在穴盤中，置于塑料大棚生長3周以后，于2017年8月24日至12月26日定植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)句容農(nóng)博園塑料大棚內(nèi)，按照單株順序編號，正常田間管理。調(diào)查親本和F2代分離群體的開花時間，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為從催芽到第1朵花開放所需要的時間（天數(shù)）。

1.2.2?CCA1基因克隆?使用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取2個親本的總RNA，具體方法參照說明書。cDNA使用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成，作為基因克隆所需的模板。CCA1基因序列參照已發(fā)表的大白菜基因組序列（http：//brassicadb.org/brad/），使用在線軟件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增的PCR引物，并由江蘇南京擎科生物科技有限公司合成（表1）。PCR擴(kuò)增體系總體積為40 μL：正反引物各 2 μL、模板cDNA 1 μL、高保真酶MIX 20 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。cDNA質(zhì)量的檢驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳方法，取5 μL DNA加入6×Loading Buffer后用1.2%瓊脂糖電泳檢測，GelRed染色，用JS-3000全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行凝膠照相。凝膠回收方法參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒。目的片段膠回收后連接到pEAZY-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，選擇陽性單克隆送至江蘇南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3?序列分析?用BioXM 2.7軟件分析2份材料CCA1基因序列的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。不同物種CCA1基因的氨基酸序列從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中搜索獲得;同源性計(jì)算利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序;氨基酸編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等通過在線軟件ProtParam（https：//web. expasy.org/Protparam/）完成;親/疏水性預(yù)測采用ProtScale（https：//web. expasy.org/protscale/）;信號肽預(yù)測采用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）;跨膜區(qū)域預(yù)測采用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用PSIPRED（http：// bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred/）等在線工具;多重序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建通過DNAMAN 5.2進(jìn)行[15]。

1.2.4?功能標(biāo)記開發(fā)?提取F2代群體極早和極晚開花植株各24株葉片的DNA，具體方法參照Axygen植物基因組DNA提取試劑盒說明書。對親本中鑒定到的CCA1編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)（InDels）設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送江蘇南京擎科生物科技有限公司測序（表1）。采用t測驗(yàn)分析親本的開花時間差異顯著性。以InDel標(biāo)記基因型作為自變量，采用單因素方差分析候選標(biāo)記（InDel）與開花時間表型的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過程中所用的軟件是SPSS 19.0。

1.2.5?CCA1基因的亞細(xì)胞定位分析?根據(jù)YS-143中克隆出的CCA1基因序列和亞細(xì)胞定位載體pEZS-NL序列，設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物（表1）。用One Step Cloning Kit構(gòu)建載體pEZS-NL-CCA1，具體操作方法參照說明書。用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞[16]，取洋蔥表皮，將其靠葉肉面向上鋪于MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 h待用，取8 μL金粉懸浮液于1.5 mL離心管中，依次加入5 μg質(zhì)粒DNA、50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亞精胺，冰浴20 min，其間間歇振蕩混勻。10 000 r/min離心5 s，棄上清，加入無水乙醇漂洗2次，棄上清，最后加入20 μL無水乙醇，懸浮待用。用基因槍轟擊洋蔥表皮，轟擊后暗培養(yǎng)16 h制片，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

2?結(jié)果與分析

2.1?親本開花時間統(tǒng)計(jì)

由圖1可知，10株親本材料YS-143在長日照條件下平均開花時間為（48±10） d，短日照條件下為（96±10） d;10株VT-044在長日照條件下平均開花時間為（105±15） d，短日照條件下在統(tǒng)計(jì)時間內(nèi)沒有開花，記為200 d。通過t測驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這2個親本在不同光周期處理下的開花時間均差異極顯著。由此證明，2個親本開花時間均受光周期影響，均為光周期敏感性材料。

2.2?CCA1基因克隆及序列分析

由圖2可知，YS-143的cDNA序列長度為1 665 bp，VT-044的序列長度為1 647 bp，除了前者比后者多了4段共18 bp的插入外，整個編碼區(qū)還有8處SNPs，其中2處是非同義突變。經(jīng)預(yù)測，第1段插入使YS-143的CCA1蛋白第110位后的氨基酸插入Arg和Lys 2個殘基;第2段插入使 YS-143的CCA1蛋白第242位后的氨基酸插入Thr和Leu 2個殘基;第3段使YS-143的CCA1蛋白第263位后的氨基酸插入Gly殘基;第4段使YS-143的CCA1蛋白第504位后的氨基酸插入Leu殘基;另外2處非同義突變分別是 YS-143 的CCA1蛋白第158位氨基酸由Val突變?yōu)長eu、第467位氨基酸由Gln突變?yōu)長ys。

由圖3可知，YS-143的基因序列包含1個長為1 665 bp的ORF;該基因編碼554個氨基酸，預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為C2591H4095N781O867S14，相對分子質(zhì)量為60.5 ku，理論等電點(diǎn)為6.20，不穩(wěn)定指數(shù)為46.60，脂肪指數(shù)為57.33。ProtScale親/疏水性預(yù)測顯示，該蛋白屬于親水性蛋白，平均親水指數(shù)為-0.872。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，其主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，分別占21.01%、76.45%，其余為延伸鏈。VT-044 的基因序列包含1個長為1 647 bp的ORF;該基因編碼548個氨基酸，預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為 C2559H4033N771O861S14，相對分子質(zhì)量為59.8 ku，理論等電點(diǎn)為5.98，不穩(wěn)定指數(shù)為46.18，脂肪指數(shù)為56.35。ProtScale親/疏水性預(yù)測顯示，該蛋白屬于親水性蛋白，平均親水指數(shù)為 -0.877。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，其主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，分別占23.5%、73.59%，其余為延伸鏈。2個基因所編碼蛋白質(zhì)均屬于不穩(wěn)定蛋白，無信號肽和分泌蛋白，也不存在跨膜區(qū)域，并且均在第19至第73氨基酸區(qū)域內(nèi)有3個MYB-DNA結(jié)合域。

2.3?CCA1基因編碼的氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用BLASTp分別對YS-143和VT-044的CCA1氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索與多重比對，結(jié)果（圖4、圖5）顯示它們與大白菜（登錄號為XP_009142594.1）相似性接近100%，與甘藍(lán)型油菜（登錄號為XP_013712324.1）和蘿卜（登錄號為XP_018441166.1）相似性分別為92%、73%，與擬南芥（登錄號為NP850460.1）和亞麻芥（登錄號為XP_010518363.1）相似性在65%以上，其中N端的MYB-DNA結(jié)合域的氨基酸序列相似度接近100%;與大麥（登錄號為BAJ92173.1）、玉米（登錄號為BAJ92173.1）和水稻（登錄號為AAR20887）的相似性均在35%以下，表明同科植物的氨基酸序列相似度較高。同源進(jìn)化樹分析表明，十字花科的不結(jié)球白菜、大白菜、蘿卜、甘藍(lán)型油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。

2.4?功能標(biāo)記開發(fā)

將4個InDel標(biāo)記在極早和極晚開花植株上的測序結(jié)果與植株開花時間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)第2處標(biāo)記（第727至第732個堿基的缺失）與材料開花時間關(guān)聯(lián)極顯著，其余3處不顯著。測序發(fā)現(xiàn)在F2代的24株極早開花的植株中，該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的有18株（與早花型母本YS-143一致），占總株數(shù)的75%，開花時間為31～56 d，平均開花時間39 d，基因型為ACCCTT/-的有3株，-/-的有3株;在24株極晚開花的植株中，該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的有0株，ACCCTT/-的有4株，基因型為-/-的有20株（與晚花型父本VT-044一致），占總株數(shù)的83%，開花時間為84～114 d，平均開花時間為104 d。因此，該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株開花時間遠(yuǎn)早于基因型為-/-的植株的開花時間，兩者之間呈極顯著差異（P<0.01）（圖6）。該InDel標(biāo)記基因型和開花時間表型的Pearson相關(guān)性分析表明，材料開花時間的早晚與基因型呈極顯著相關(guān)（r=0.991，P<0.01）。表明CCA1基因的第727至第732個堿基的變異（A05：472204-472209）與開花時間呈極顯著相關(guān)，會影響植株的開花時間，可以為白菜類作物光周期影響開花時間的研究提供理論依據(jù)。同時，該位點(diǎn)可以作為功能分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作，加快育種進(jìn)程。

2.5?CCA1基因的亞細(xì)胞定位分析

利用亞細(xì)胞定位在線預(yù)測軟件WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort.html）對CCA1基因在細(xì)胞中表達(dá)的位置進(jìn)行預(yù)測，顯示CCA1基因有91.3%的可能性定位在細(xì)胞核上。而通過在洋蔥表皮中進(jìn)行的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)（圖7）發(fā)現(xiàn)，在陽性對照中，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上都能觀察到綠色熒光?而來源YS-143的CCA1蛋白的熒光信號主要集中在細(xì)胞核上，說明CCA1基因主要在細(xì)胞核上發(fā)揮功能。

3?討論與結(jié)論

在光周期條件下，白菜類作物具有不同的敏感性反應(yīng)。張學(xué)銘對100份白菜類作物抽薹開花性狀的光周期敏感性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)具有較大差異[3]。本研究所用材料YS-143在長日照條件下平均開花時間為（48±10） d，短日照條件下為（96±10） d;VT-044在長日照條件下平均開花時間為（105±15） d，短日照條件下在統(tǒng)計(jì)時間內(nèi)沒有開花。因此，選取的YS-143和VT-044均為光周期敏感類型，可以作為試驗(yàn)材料進(jìn)行光周期變化對開花時間影響的研究。

研究者分別從楊樹、大麥、玉米等植物中克隆到了相應(yīng)的CCA1基因，分子進(jìn)化關(guān)系表明，它們之間氨基酸序列的同源性較高，且在單、雙子葉植物間非常保守，其N端的核酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度高達(dá)79%以上[17-19]。這與本研究結(jié)果類似，筆者也發(fā)現(xiàn)2個材料與大白菜、甘藍(lán)型油菜、蘿卜的基因序列具有較高同源性，與擬南芥、亞麻芥的進(jìn)化距離也較近，其中N端的核酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度接近100%。Yi等對來自3個蕪菁自交系（RCBr、Kenshin、Chiifu）的CCA1基因序列進(jìn)行了分析，在第4內(nèi)含子上鑒定出高水平的序列變異，并據(jù)此開發(fā)出1個InDel標(biāo)記，進(jìn)而分別用PCR及HRM（high-resolution melting）技術(shù)2種方法對其進(jìn)行驗(yàn)證，均證明該第4內(nèi)含子上的序列變異可以作為InDel分子標(biāo)記參[CM（25]與蕪菁的育種工作[12]。張志剛等在2個大白菜品種上克隆CCA1基因的cDNA序列，分別在329 bp（第4外顯子）處和第1 407 bp（第7外顯子）處開發(fā)出2個InDel分子標(biāo)記，并利用PCR法進(jìn)行了驗(yàn)證[13]。本研究選擇更有可能對植物表型造成影響的外顯子序列進(jìn)行分析，將分別在第330 bp（第4外顯子）、第726 bp（第6外顯子）、第789 bp（第6外顯子）和第1 515 bp（第7外顯子）處鑒定到的4段序列差異與F2代分離群體的開花時間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于第726 bp處的序列差異與開花時間相關(guān)，其余3段不相關(guān)。其中第4外顯子上的序列差異與張志剛等鑒定到的序列[13]位置相近、序列相同。同時筆者也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體中基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株的開花時間并不是都早于基因型為-/-的植株。其主要原因可能是開花時間并不只受CCA1基因控制，而是受多個開花時間相關(guān)基因和多條路徑相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)控的。在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)CCA1基因定位在細(xì)胞核上[20]。本研究通過亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜YS-143中的CCA1基因在細(xì)胞核上表達(dá)，表明在擬南芥到白菜類作物進(jìn)化過程中，CCA1基因依然在細(xì)胞核中發(fā)揮原有的作用。

已有研究指出，在現(xiàn)代育種中改良某個特定的優(yōu)良性狀最有效的途徑就是選擇攜帶某一性狀的目的基因的供體親本進(jìn)行回交，同時利用各種分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，迅速地將與分子標(biāo)記連鎖的基因轉(zhuǎn)移到另外一個品種上，從而顯著加速育種年限[21]。本研究關(guān)于CCA1基因功能標(biāo)記的開發(fā)與利用，可為白菜類作物分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論依據(jù)和現(xiàn)實(shí)意義，為開發(fā)通用的白菜類作物InDel標(biāo)記提供了重要的一步。

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