蘭蓉 沈榮 王佔剛

摘要：為探究光質(zhì)對螺旋藻抗氧化成分和活性的影響規(guī)律，以發(fā)光二極管（LED）為光源，以白光為對照，在5種單色光和5種紅藍組合光下培養(yǎng)螺旋藻，測定其次生代謝類抗氧化成分含量、抗氧化酶活性和總抗氧化能力。結(jié)果表明：藍光顯著提高螺旋藻維生素C含量、黃酮含量、抗氧化酶活性和總抗氧化能力;黃光組的維生素C含量、黃酮含量、總抗氧化能力最低;綠光和藍光顯著提高維生素E含量;紅光組的維生素E含量、抗氧化酶活性最低;藍光比例為20%的紅藍組合光處理后，螺旋藻維生素C和黃酮含量達到最高值;藍光比例為30%的紅藍組合光處理后，維生素E含量、抗氧化酶活性和總抗氧化能力達到最高值。因此，藍光和紅藍組合光是螺旋藻合成抗氧化成分的高效光質(zhì)，藍光比例為20%～30%的紅藍組合光最利于螺旋藻抗氧化成分的合成和積累。

關(guān)鍵詞：發(fā)光二極管;光質(zhì);螺旋藻;抗氧化

中圖分類號： S968.4?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0184-04

螺旋藻又稱藍細菌（cyanlbacteria），是地球上最古老的光合生物之一。國內(nèi)外大量研究表明[1-3]，螺旋藻營養(yǎng)全面且富含多種抗氧化活性成分，是一種安全可靠的天然抗氧劑，可以提高機體的抗氧化能力，對抗活性氧及自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化及相關(guān)疾病。因此，提高螺旋藻中抗氧化活性成分含量從而進一步改善其營養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義。

發(fā)光二極管（LED）燈具有體積小、節(jié)能、壽命長、波長可控和熱輻射低等優(yōu)勢，目前已經(jīng)成為受控環(huán)境中植物生長所用的首選光源[4-5]。一些植物方面的研究表明，通過優(yōu)化光質(zhì)條件可以提高植物中抗氧化活性成分的含量。增加藍色LED光質(zhì)比例可促進櫻桃番茄果實中番茄紅素和類黃酮的形成[6]。紅光能夠明顯地增加豌豆苗β-胡蘿卜素的含量以及對健康有益的營養(yǎng)成分的抗氧化活性[7]。目前，關(guān)于光質(zhì)對螺旋藻生長和形態(tài)影響的研究較多[8-11]，而對抗氧化活性成分積累的研究鮮有報道。本研究采用不同的LED光源，設(shè)置5種單色光和5種紅藍組合光對鈍頂螺旋藻進行培養(yǎng)，探究不同光質(zhì)對螺旋藻抗氧化成分和活性的影響規(guī)律，篩選螺旋藻高效培養(yǎng)光質(zhì)條件，為定向培育螺旋藻的光環(huán)境調(diào)控技術(shù)和改善螺旋藻營養(yǎng)品質(zhì)提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），由中國科學院水生生物研究所藻類生物學重點實驗室提供。

1.2?試驗方法

1.2.1?螺旋藻的培養(yǎng)

鈍頂螺旋藻按照3.5%（體積分數(shù)）的接種量接種在裝有適量Z氏培養(yǎng)液[12]的氣升式光反應(yīng)器中。光源為深圳方洲照明有限公司的LED燈珠，反應(yīng)器中心的光合有效輻射強度（PAR）為3.90 mW/cm2。反應(yīng)器的培養(yǎng)溫度為25 ℃，CO2濃度為500 mg/L，通氣量為0.6 L/min，光周期為23 h/d，培養(yǎng)周期為7 d，重復3次[13]。試驗設(shè)10種光質(zhì)處理：白光（全光譜，W）、紅光（620～630 nm，R）、黃光（580～590 nm，Y）、藍光（460～470 nm，B）、綠光（520～530 nm，G）、紅光 ∶藍光=9 ∶1（9R1B，紅光比例90%）、紅光 ∶藍光=8 ∶2（8R2B，紅光比例80%）、紅光 ∶藍光=7 ∶3（7R3B，紅光比例70%）、紅光 ∶藍光=6 ∶4（6R4B，紅光比例60%）、紅光 ∶藍 光=5 ∶5（5R5B，紅光比例50%），以白光作為對照。

1.2.2?螺旋藻樣品的前處理

培養(yǎng)結(jié)束后，收集螺旋藻藻液，用400目濾網(wǎng)過濾，-20 ℃冷凍，用冷凍干燥機完全凍干后研磨，過40目篩，備用。

1.2.3?維生素C含量的測定

1.2.3.1?維生素C標準曲線的制備?稱取25 mg維生素C，用1% HCl定容到100 mL，量取上述溶液10 mL，用1% HCl定容到100 mL，得到25 μg/mL維生素C標準溶液。分別量取上述溶液2、4、6、8、10 mL，用蒸餾水定容到25 mL，在波長243 nm處測定D值。以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標制作標準曲線。結(jié)果標準方程為ρ=16.626D-0.032，r2=0.999 4。

1.2.3.2?樣品維生素C的測定?稱取固體樣品50 mg，加1% HCl溶解定容到10 mL，超聲15 min，過濾，取過濾液2 mL加1% HCl 2 mL，用蒸餾水定容到25 mL，在波長243 nm處測定D值。

1.2.4?總黃酮含量的測定

1.2.4.1?黃酮標準曲線的制備?稱取蕓香苷10 mg，用60%乙醇完全溶解，在50 mL容量瓶中定容到刻度線，得到 0.2 mg/mL 蕓香苷對照品溶液。精密吸取蕓香苷對照品0、1、2、3、4、5 mL分別置于25 mL容量瓶中，補加蒸餾水使所有容量瓶內(nèi)溶液在相同高度，加1 mL 5% NaNO2，室溫放置 6 min;加1 mL 10% Al（NO3）3，室溫放置6 min，加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25 mL，搖勻放置15 min，在波長 505 nm 處測定各溶液的D值，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標制作標準曲線。結(jié)果標準方程為ρ=0.086 9D-0.000 6，r2=0.999 9。

1.2.4.2?樣品總黃酮的測定?稱取固體樣品100 mg，加入 1 ∶25 的HCl-乙醇（1% HCl、70%乙醇）定容到10 mL，超聲15 min，取上清液2 mL，加1 mL 5% NaNO2，室溫放置6 min;加1 mL 10% Al（NO3）3，室溫放置6 min，加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25 mL，在波長505 nm處測定D值。

1.2.5?抗氧化酶活性、維生素E含量和總抗氧化能力的測定

1.2.5.1?過氧化物酶（POD，EC 1.11.1-X）活性的測定?凍干樣品10 mg溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.2）中，冰水浴條件下超聲15 min，制成5%的勻漿液，4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，上清液進行POD活性測定。

1.2.5.2?超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）活性的測定?參照“1.2.5.1”節(jié)的方法，制成2.5%的勻漿液后離心 10 min，上清液進行SOD活性測定。

1.2.5.3?維生素E含量的測定?參照“1.2.5.1”節(jié)的方法，制成1%的勻漿液后離心10 min，上清液進行維生素E含量測定。

1.2.5.4?總抗氧化能力（T-AOC）的測定?參照“1.2.5.1”節(jié)的方法，制成10%的勻漿液后離心10 min，上清液進行 T-AOC 測定。

POD活性、SOD活性、維生素E含量和T-AOC的測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.2.6?統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件的方差分析（AVONA）程序進行方差分析，并對不同處理的平均值進行多重比較（Duncan's，α=0.05），以P<0.05和P<0.01作為統(tǒng)計學顯著和極顯著意義。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同光質(zhì)對螺旋藻次生代謝類抗氧化劑含量的影響

光質(zhì)條件對螺旋藻次生代謝類抗氧化劑維生素C、維生素E和總黃酮的含量有顯著影響（表1）。

由表2可知，單色光處理后，黃光組、紅光組和綠光組的維生素C含量與總黃酮含量均低于白光組（對照組），其中黃光組的維生素C含量和總黃酮含量最低，分別比對照組降低33.63%和18.83%;藍光顯著提高螺旋藻維生素C含量和總黃酮含量，分別比對照組提高6.19%和14.60%。與對照相比，綠光和藍光顯著提高維生素E的含量，分別提高 17.96% 和15.82%;黃光組與對照組的維生素E含量差異不顯著;紅光組的維生素E含量顯著低于對照組。

紅藍組合光處理后，隨著組合光中藍光比例的增加，螺旋藻維生素C、維生素E和總黃酮的含量呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢。8R2B組的維生素C含量達到最高值，比對照組增加10.73%;7R3B組的維生素C含量與對照組差異不顯著，6R4B組、5R5B組的維生素C含量均顯著低于對照組;紅藍組合光中，各處理組的維生素E含量均顯著高于對照組，其中7R3B組的維生素E含量最高，其次是8R2B組，分別比對照組提高27.39%和22.86%;8R2B、7R3B和6R4B這3組的總黃酮含量均顯著高于對照組，其中8R2B組最高，比對照組提高66.49%，其次是7R3B組和6R4B組，分別提高38.74%和36.59%，9R1B組和5R5B組的總黃酮含量與對照組差異不顯著。

可見，藍光有利于維生素C、維生素E和總黃酮等次生代謝抗氧化物質(zhì)的合成，紅光、黃光則分別抑制螺旋藻維生素E、維生素C和總黃酮積累;紅藍組合光總體上比單色光更有利于促進螺旋藻次生代謝類抗氧化劑的積累;藍光比例為20%～30%的紅藍組合光最有益于螺旋藻次生代謝類抗氧化劑的生成。

2.2?不同光質(zhì)對螺旋藻抗氧化酶活性的影響

光質(zhì)條件對螺旋藻SOD和POD活性有顯著影響（表1）。由圖1可看出，單色光中，黃光、藍光和綠光3組的SOD活性（圖1-A）與POD活性（圖1-B）均顯著高于對照組，其中藍光組的SOD和POD活性均最高，分別是對照組的2.20倍和3.34倍;紅光組的SOD和POD活性均與對照組差異不顯著。紅藍組合光中，各試驗組SOD和POD活性隨光質(zhì)變化的趨勢較一致，活性從高到低依次均為7R3B>8R2B>6R4B>9R1B>5R5B，其中9R1B、8R2B、7R3B和6R4B這4組的SOD與POD活性均顯著高于對照組，5R5B組的SOD活性與對照組差異不顯著，但其POD活性顯著高于對照組;隨著組合光中藍光比例的增加，螺旋藻SOD活性和POD活性均呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢;藍光比例為30%時，SOD和POD活性達到最高值，分別是對照組的2.26、3.41倍，但與藍光組無顯著差異?？梢?，藍光組和紅藍組合光比其他處理組更有利于螺旋藻抗氧化酶活性的提高。

2.3?不同光質(zhì)對螺旋藻總抗氧化能力的影響

光質(zhì)條件對螺旋藻總抗氧化能力（T-AOC）有顯著影響（表1），但不同光質(zhì)對螺旋藻總抗氧化能力的影響不同（圖2）。由圖2可看出，在單色光中，藍光組與紅光組的總抗氧化能力顯著高于對照組，分別比對照組增加33.83%和 17.05%;黃光組與綠光組的總抗氧化能力顯著低于對照組，分別比對照組降低50.02%和33.03%。在紅藍組合光中，隨著藍光比例的增加，螺旋藻總抗氧化能力呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，從高到低依次為7R3B>8R2B>6R4B>9R1B>5R5B，其中8R2B、7R3B和6R4B這3組的總抗氧化能力均顯著高于對照組，分別比對照組增加了42.82%、46.28%和 29.29%，藍光比例為30%的7R3B組總抗氧化能力最高;9R1B組和5R5B組的總抗氧化能力與對照組差異不顯著。可見，紅藍組合光總體上更有利于螺旋藻總抗氧化能力的提高。

2.4?螺旋藻抗氧化成分含量與總抗氧化能力的相關(guān)性分析

由表3可知，螺旋藻中維生素C含量、總黃酮含量與其總抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，而維生素E含量、SOD活性和POD活性與其總抗氧化能力間無顯著相關(guān)性。結(jié)果表明，螺旋藻維生素C和總黃酮含量的增加有利于提高螺旋藻的總抗氧化能力。

3?討論與結(jié)論

光質(zhì)是螺旋藻人工培養(yǎng)過程中一個重要的環(huán)境因素，它不僅能夠影響螺旋藻的生長、藻絲體的形態(tài)建成和色素組成，還能夠調(diào)節(jié)螺旋藻次生代謝產(chǎn)物的合成。本研究表明，不同光質(zhì)處理對螺旋藻中維生素C、維生素E和總黃酮等次生代謝抗氧化物質(zhì)的合成和積累有顯著影響。單色光中，藍光有利于維生素C、維生素E和總黃酮等次生代謝抗氧化物質(zhì)的合成，而黃光處理的螺旋藻維生素C和總黃酮含量最低，這與前人的研究結(jié)果相符[13-15]。藍光可提高維生素C合成途徑中關(guān)鍵酶——半乳糖酸內(nèi)酯脫氫酶的活性[16]，還可刺激一些影響黃酮類化合物合成的主要酶——苯丙氨酸裂解酶（PAL）等的活性或上調(diào)其相關(guān)基因的表達[17]，這些可能是藍光增加維生素C、維生素E和總黃酮含量的原因。紅藍組合光中，藍光比例為20%時，螺旋藻維生素C和總黃酮含量最高，藍光比例為30%時，螺旋藻維生素E含量最高，三者均高于單色光最高值，說明紅藍組合光較單色光更有利于次生代謝抗氧化物質(zhì)的合成和積累，可能是各單色光間具有互補和加性效應(yīng)[18]。劉建福等的研究也表明，紅藍組合光有益于次生代謝產(chǎn)物的積累[19]。

SOD和POD是生物體抗氧化酶體系的關(guān)鍵組成部分，能清除生物體在逆境中產(chǎn)生的氧自由基，形成一定程度的保護作用，從而延緩生物體的衰老與死亡。周琳等發(fā)現(xiàn)白光、藍光處理后的茶樹愈傷組織抗氧化酶活性較高，而紅光處理后的活性則顯著低于其他處理組[20]。王虹等的研究表明，藍光可誘導黃瓜抗氧化酶基因的表達和酶活的上升[21]。還有研究表明，藍光處理后的茅蒼術(shù)抗氧化酶活性顯著高于紅藍組合光組[22]。原因可能是藍光具有較高的能量，易造成藍光損傷[23-24]，細胞需要合成更多的抗氧化劑來降低氧化脅迫。本研究結(jié)果與上述報道基本相符，但藍光組與紅藍組合7R3B組的SOD與POD活性水平無顯著差異。另外，本試驗中SOD和POD活性隨光質(zhì)變化的趨勢較一致，這是因為生物體抗氧化酶體系是協(xié)同作用防止活性氧的損傷效應(yīng)，SOD將超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，POD則把SOD等產(chǎn)生的H2O2變成H2O，使活性氧維持在較低水平上。

總抗氧化能力與次生代謝產(chǎn)物是否具有相關(guān)性，目前的研究結(jié)果不盡相同。任錦等的研究認為紫背天葵葉片黃酮含量與其抗氧化活性之間存在較高的相關(guān)性[25]。但李亞華等的研究發(fā)現(xiàn)茄子果肉黃酮含量與其總抗氧化能力間無顯著相關(guān)性，而維生素C含量與其總抗氧化能力呈顯著正相關(guān)[26]。本研究中，螺旋藻總黃酮和維生素C含量與其總抗氧化能力均呈顯著正相關(guān)，表明本試驗條件下螺旋藻的總抗氧化能力主要是由黃酮和維生素C決定的。

綜上所述，藍光顯著提高螺旋藻維生素C含量、總黃酮含量、抗氧化酶活性和總抗氧化能力，綠光和藍光顯著提高維生素E含量，而黃光抑制維生素C和黃酮的生成，紅光抑制維生素E的合成并降低抗氧化酶活性;紅藍組合光中藍光比例為20%時，螺旋藻維生素C和總黃酮含量達到最高值;藍光比例為30%時，維生素E含量、抗氧化酶活性和總抗氧化能力達到最高值。因此，紅藍組合光和藍光是螺旋藻合成抗氧化成分的高效光質(zhì)，藍光比例為20%～30%的紅藍組合光最利于螺旋藻抗氧化成分的合成和積累。本研究只考慮了光質(zhì)對螺旋藻抗氧化成分的影響，今后應(yīng)結(jié)合螺旋藻生長階段、光照強度和光照時間等因素開展進一步研究，為螺旋藻的優(yōu)質(zhì)高效培養(yǎng)奠定良好基礎(chǔ)。

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