徐麗華，蘭勝芝，李軍星，余斌，張鵬超，李寶臣，袁秀芳*

(1.浙江省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江詩華諾倍威生物技術有限公司，浙江 杭州 310018)

支原體(mycoplasma)是一種介于病毒和細菌之間的多形性微生物，廣泛存在于人體、畜禽、昆蟲、植物及土壤污水等自然界中[1]，能引起人、動物和植物的多種疾病，且大都具有傳染性[2-3]。在養(yǎng)豬業(yè)中，現已證實的支原體有豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬腹支原體、豬喉支原體、豬絮狀支原體等[3]。豬肺炎支原體能引起豬的一種低死亡率、高發(fā)病率的慢性呼吸道傳染病，患病豬只生長緩慢，飼料利用率低下[3-4]；豬鼻支原體定植于仔豬呼吸道表面，能引起豬的多發(fā)性漿膜炎、中耳炎和關節(jié)炎；豬滑液支原體感染關節(jié)和扁桃體，引起豬的軟骨病和關節(jié)炎[5]。這3種支原體或與其他呼吸系統(tǒng)疾病混合感染，導致豬死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經濟損失。近年來，浙江省生豬存欄量增加，飼養(yǎng)密度高，豬病特別是呼吸道疾病發(fā)生率居高不下。本實驗室對2014—2018年浙江省內送檢的臨床疑似病豬進行3種豬支原體的流行病學調查，旨在了解浙江省3種支原體的流行狀況，為制定有效的防治措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體陽性樣品由本實驗室分離鑒定保存。臨床案例為2014—2018年采集自浙江省不同規(guī)模豬場，具有關節(jié)腫脹、肺小葉實變、心包積液等臨床疑似支原體病變豬只。

1.2 試劑和儀器

病毒DNA提取試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司(L0t0507)，Taq DNA聚合酶、1 000 bp DNA Marker、dNTPs等購自上海生工生物工程技術服務有限公司，無水乙醇等化學試劑均為國產分析純。

1.3 引物合成

參考Stakenborg等[6]公布的引物序列，委托上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.4 DNA模板制備

從-70 ℃取出臨床病料0.1 g，置于Eppendorf管中，加入pH 7.0 PBS緩沖液0.5 mL，勻漿機碾磨成勻漿，離心取上清0.1 mL。按照病毒DNA提取試劑盒說明書操作，提取DNA模板于-20 ℃保存。

1.5 PCR擴增

用提取的3種支原體DNA作為模板，分別擴增3種支原體基因片段。反應體系分別為25 μL，在PCR反應管中分別加入10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mM dNTPs 2.0 μL、上、下游引物各1.25 μL、DNA模板2.5 μL、Taq酶0.2 μL、雙蒸水15.3 μL。擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應完成后，取5 μL PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用BIO-RAD成像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結果與分析

2014—2018年，浙江省不同縣市的養(yǎng)豬場采集臨床疑似病料238份，分別進行豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體擴增，擴增片段分別為1 000、1 129、754 bp。

結果(圖1)顯示，臨床疑似樣品中豬肺炎支原體檢測陽性數為45份，陽性率18.9%；豬鼻支原體陽性數為105份，陽性率為44.1%；豬滑液支原體陽性數為0。

M—1 000 bp DNA Marker；1—臨床樣品；2—陰性對照；3—陽性對照。A—豬肺炎支原體；B—豬鼻支原體；C—豬滑液支原體。圖1 3種支原體的PCR擴增結果

在不同年份檢測3種豬支原體病原，其中2014—2018年分別檢測58、74、45、38、23份。2014—2018年豬肺炎支原體陽性率分別為12.1%、20.3%、20.0%、34.2%、4.3%；豬鼻支原體陽性率分別為51.8%、47.3%、40%、42.1%、26.1%；豬滑液支原體陽性率均為0。2014—2018年，豬肺炎支原體和豬鼻支原體發(fā)生混合感染24份，分別為5、10、5、4和0份，兩者混合感染比例為10.08%。

3 討論

豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體能引起患病豬關節(jié)腫大，心包積液，咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，已經成為豬場的常見病和慢性多發(fā)病，因其常發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，已嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前檢測支原體的方法主要有分離培養(yǎng)、血清學法和PCR方法等。豬支原體分離培養(yǎng)條件苛刻，且生長速度緩慢，需要1周甚至更長時間才能觀察其形態(tài)，也容易造成實驗環(huán)境污染。血清學方法可檢測豬肺炎支原體和豬滑液支原體的抗體水平，不能直接反映病原感染情況。本試驗采用PCR方法，從疑似病料中分別檢測3種支原體的感染情況，給養(yǎng)殖場確診疫病提供了快速準確的方法。

調查發(fā)現，豬滑液支原體檢出率為0，說明該病原近幾年在浙江省地區(qū)沒有流行。豬肺炎支原體、豬鼻支原體檢出率分別為18.9%、44.1%，豬鼻支原體感染率明顯高于豬肺炎支原體，與Joyce等[7]對江蘇省豬肺炎支原體和豬鼻支原體感染的調查結果符合。實際生產中，大部分豬場均會接種豬肺炎支原體疫苗，尚無豬鼻支原體疫苗，且一般抗菌藥物對豬鼻支原體治療效果不佳，導致豬場豬鼻支原體發(fā)病率高于豬肺炎支原體。同時，豬鼻支原體可能污染PK-15等細胞，導致豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗等細胞苗污染，在豬場免疫接種時同時接種了豬鼻支原體。研究發(fā)現，豬肺炎支原體和豬鼻支原體混合感染病例24份，混合感染比例10.08%，說明豬場發(fā)病豬存在兩者混合感染的現象。2018年8月，由于豬場疫病暴發(fā)，各地豬場嚴進嚴出，臨床病料減少，豬支原體檢出率下降。2014—2017年，豬肺炎支原體檢出率有逐年上升趨勢，豬鼻支原體每年略有下降。分析原因，近幾年臨床上大量使用支原凈等抗生素，導致豬肺炎支原體耐藥性越來越嚴重，豬肺炎支原體發(fā)病率有所反彈[8]。另外，2014年豬常見疫苗中豬鼻支原體污染嚴重，疫苗免疫時人為接種豬群可能性大，隨著豬場及經銷商對豬鼻支原體污染細胞培養(yǎng)物問題的重視，近幾年豬鼻支原體污染逐漸減少。