郭鵬 李漢周 劉松林 林剛 紀(jì)燕娟 朱國(guó)強(qiáng)

1.中石化江蘇油田分公司石油工程技術(shù)研究院 2.江蘇省油氣微生物技術(shù)工程研究中心 3.中石化江蘇油田分公司采油一廠

含油污泥是在石油開采、油氣集輸、煉制加工及含油污水處理過程中產(chǎn)生的一種由原油、水、重金屬和污泥組成的固體廢棄物。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，“十一五”末我國(guó)每年產(chǎn)生含油污泥總量超過500×104t，按排污標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算費(fèi)用，直接處理成本高達(dá)50億元。含油污泥具有污泥數(shù)量大、費(fèi)用高的特點(diǎn)[1]。污泥中除含有大量殘留油類外，還含有蒽、酚類等有毒物質(zhì)，寄生蟲、病原菌以及Cr、Cu、Pb等重金屬，多氯聯(lián)苯、二噁英、放射性元素等有毒有害物質(zhì)，若不加以處理，不僅污染環(huán)境，而且還造成資源浪費(fèi)[2]。含油污泥黏度大、乳化程度高，油、泥、水三相分離困難，同時(shí)因含油污泥的來(lái)源不同，其性質(zhì)差別較大，因而具有處理難的特點(diǎn)[3-4]。

相對(duì)于物理和化學(xué)處理技術(shù)，含油污泥生物處理技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便，處理成本低，作用持久，無(wú)二次污染，已在國(guó)外得到商業(yè)化應(yīng)用[5]。特定微生物對(duì)含油污泥中的石油和有機(jī)物有很強(qiáng)的降解能力，最終可轉(zhuǎn)化成無(wú)害的CO2、H2O等[6]。同時(shí)，處理過程中能夠增加土壤腐殖質(zhì)含量，其處理方式包括堆肥處理法、土壤耕作法、微生物降解法等[7-8]。MISHRA等[6]采用原位生物修復(fù)技術(shù)研究了微生物對(duì)煉油廠含油污泥的處理能力，加入培養(yǎng)好的菌種與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)120天后，油含量(原最高為99.2 g/kg)降低了90.2%；歐陽(yáng)威等[9]采用微生物菌劑強(qiáng)化和堆制強(qiáng)化技術(shù)對(duì)油含量為 12.68%的污泥進(jìn)行處理，56 天后，油含量降至6.42%。GC-MS 分析得出，微生物菌劑強(qiáng)化分解僅對(duì)碳原子數(shù)小于21的直鏈烷烴有著良好的降解效果，因而該技術(shù)存在難以選擇到合適的菌種，處理周期長(zhǎng)，對(duì)環(huán)烷烴、芳烴類等非直鏈烷烴處理效果差，對(duì)油田含油污泥難適應(yīng)等問題[10-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

離心管、塑料袋、取樣鏟、保溫盒；LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g(Bact-tryptone;Qbiogene 進(jìn)口)、酵母膏5 g(yeast extract；Qbiogene 進(jìn)口)、NaCl 10 g、瓊脂18 g、Tris-HCl (Premega 進(jìn)口)、EDTA-Na2(Premega進(jìn)口)、β-巰基乙醇 (FLUKA進(jìn)口)、氯仿(FLUKA進(jìn)口)、異戊醇(FLUKA進(jìn)口)。

-80 ℃超低溫冰箱、制冰機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋(Tony)、超凈操作臺(tái)、培養(yǎng)箱、高倍顯微鏡、生物顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、751型分光光度計(jì)、恒溫水浴、核酸電泳設(shè)備。

采集江蘇油田站點(diǎn)含油污泥及污水。樣品置于已滅菌、密閉的離心管中，密封保藏于低溫容器內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1菌株的富集、分離純化

稱取5 g含油污泥或5 mL污水水樣，加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床條件下培養(yǎng)，5天后吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)5天。如此連續(xù)富集培養(yǎng)25天.培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)。

待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落，采用劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化，直到得到單菌株的純培養(yǎng)物，純化后的菌株保存于培養(yǎng)基斜面。

1.2.2菌株的篩選

(1)初篩。將純化的菌株分別接種到裝有100 mL降解用液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，觀察各菌株在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，篩選出生長(zhǎng)較快、菌落較多的菌株并鏡檢觀察菌株形態(tài)。

(2)復(fù)篩。挑取各菌株的單菌落分別接種到裝有50 mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌液在600 nm處的吸光度，用滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度，使光密度(optical density,OD)600 nm約為0.4，以此稀釋的菌液作種子接種篩選培養(yǎng)基。

(3)評(píng)價(jià)。吸取5 mL準(zhǔn)備好的種子液接種到裝有100 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4天后測(cè)定石油含量。每次單菌落評(píng)價(jià)做3次重復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)3次試驗(yàn)的平均除油率，篩選得到除油率較高的菌株。

(4)分子生物學(xué)鑒定。設(shè)計(jì)16S rDNA 通用引物(Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer B：5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’)，以分離篩選菌株DNA為模板，采用菌落PCR方法進(jìn)行16S rDNA 序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：ddH2O 34 μL、10×buffer 5 μL、5 μL Mg2+、dNTP 2.5 μL、rTaq 0.5 μL、Primer A與Primer B各1 μL、模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環(huán)33次；72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物連接克隆載體pEASY-T3并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top-10中，由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序的16S rDNA序列與已登錄Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的基因片段進(jìn)行blast比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件比較同源性和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 降解試驗(yàn)與討論

2.1 污泥組成

由于油田含油污泥本身的非均相特點(diǎn)，在不同站點(diǎn)及同一站點(diǎn)不同位置的污泥，其形狀差異較大。現(xiàn)場(chǎng)采集站點(diǎn)2中3#樣品，測(cè)試污泥組成，油泥兩項(xiàng)組分中油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.4%。污泥組成及干污泥中重金屬含量見表1。

表1 站點(diǎn)2中3#樣品原始污泥組成Table 1 Composition of raw sludge in sample 3#組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·kg-1)油2.3硼122.1水89.0鎳33.6油水不溶物9.0汞0.4鉛32.6砷11.4鉻45.7

2.2 菌株篩選

使用上述初篩方法，觀察各菌株在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，篩選出生長(zhǎng)較快、菌落較多的菌株并鏡檢觀察菌株形態(tài)。根據(jù)菌株特性及生長(zhǎng)繁殖速度，初步篩選得到12株菌，顯微形態(tài)見圖1。

使用上述復(fù)篩方法，篩選出除油率較高的4株菌株，代號(hào)分別為Yn-33、Yn-1、Yn-5、Yn-3。

將復(fù)篩得到的菌株接種到含原油(質(zhì)量濃度為85 mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，200 r/min搖床培養(yǎng)7天，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定殘余油吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出殘余油的質(zhì)量濃度，計(jì)算篩選菌株對(duì)原油的除油率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，Yn-1和Yn-3培養(yǎng)7天后的除油率分別為22.7%和20.9%，相對(duì)于其他具有較好活性的菌株，具有更強(qiáng)的原油降解效率，說明分離篩選的石油烴降解菌株Yn-1和Yn-3對(duì)石油烴具有較高活性和適應(yīng)性，能有效降解培養(yǎng)基中原油物質(zhì)。進(jìn)一步改善菌株的降解環(huán)境條件，提高菌劑降解效率為技術(shù)工藝的重點(diǎn)。

采用分子生物學(xué)鑒定方法，判定菌株Yn-1和Yn-3分別為短芽孢桿菌(Bacillus brevis)和賴氨酸芽孢桿菌(Bacillus lysine)。

2.3 菌種制備

將篩選出的石油烴降解菌株接種在篩選配方固體培養(yǎng)基的方形瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)3～4天，形成細(xì)菌芽胞以制備菌種。無(wú)菌條件制備孢子懸浮液，經(jīng)70～75 ℃水浴10～15 min，獲得發(fā)芽勢(shì)強(qiáng)、發(fā)育一致的孢子懸浮液，作為發(fā)酵菌種用于接種培養(yǎng)及小試試驗(yàn)。

2.4 生物活化劑的篩選

油田含油污泥中水含量、油含量較高(見圖3)。油田含油污泥一般黏度大、乳化程度高，油、泥、水三相分離困難，使得油田含油污泥的生物降解過程難度較大。改善生物降解環(huán)境是提高生物降解效率的重要途徑，在原始污泥中投加生物活化劑是重要手段之一。以站點(diǎn)2中3#樣品為對(duì)象，試驗(yàn)中考察污泥在不投加菌劑而單純投加不同生物活化劑條件下的對(duì)油泥團(tuán)粒結(jié)構(gòu)影響及其對(duì)相同菌株生物降解最終效果的影響，優(yōu)選生物活化劑。

將定量油泥與定量的麥麩等4種生物活化劑(代號(hào)分別為E-M、E-D、E-T、E-G)混合后，置于25 ℃干燥箱中使水分自然蒸發(fā)，待水分蒸發(fā)至小于10%時(shí)，取出樣品，采樣，使用篩分法進(jìn)行分級(jí)試驗(yàn)，分析處理油泥土樣團(tuán)粒結(jié)構(gòu)組成。

由圖4可見，油泥中添加不同活化劑成分后，油泥團(tuán)粒結(jié)構(gòu)有較大變化。4種生物活化劑中以E-G對(duì)油泥團(tuán)粒結(jié)構(gòu)影響最大，處理油泥團(tuán)粒中大粒級(jí)(>5 mm、3～5 mm、1～3 mm)達(dá)21.1%，其次為E-D和E-M。采集站點(diǎn)2中3#含油污泥樣品，分別配制包含上述4種生物活化劑和相同菌劑的污泥生物反應(yīng)系統(tǒng)，混合后置于小試裝置中，在菌劑與生物活化劑共同作用下，進(jìn)行20天生物降解試驗(yàn)，過程中污泥外觀性狀變化，如圖5所示。

測(cè)試對(duì)比經(jīng)不同生物活化劑體系處理的污泥除油效果，結(jié)果見圖6。從污泥除油率的變化上看，生物活化劑的投加顯著增強(qiáng)了油泥中石油烴的降解效果。其中，采用E-G生物活化劑體系菌劑的除油效果最好，培養(yǎng)箱處理20天后，除油率達(dá)85.21%；E-T、E-D體系處理的，除油率分別為83.72%、82.21%，對(duì)照樣品CK，其除油率僅13.58%。

2.5 試驗(yàn)裝置與流程

為評(píng)價(jià)開發(fā)的菌株對(duì)于污泥中石油烴降解效果及其影響因素，評(píng)價(jià)生物活化劑體系對(duì)其他不同站點(diǎn)污泥的除油效果，設(shè)計(jì)開發(fā)了小試裝置。該裝置由生物反應(yīng)、供氣、記錄等幾個(gè)單元組成，每批次可獨(dú)立進(jìn)行3個(gè)箱體生物降解試驗(yàn)，試驗(yàn)中每個(gè)箱體中可填充10 kg污泥(見圖7)。

試驗(yàn)中，分別采集不同站點(diǎn)的原生含油污泥，在定量污泥中依次投加不同的污泥生物活化劑、Yn-1和Yn-3菌劑等物料，均質(zhì)后，置于圖7所示的試驗(yàn)裝置中，開展含油污泥生物降解試驗(yàn)，周期性記錄降解過程中溫度等參數(shù)的變化，試驗(yàn)結(jié)束后取樣測(cè)試污泥中殘余油含量，評(píng)價(jià)除油效果。

2.6 降解試驗(yàn)與降解效果

按照上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇E-G生物活化劑體系，采集現(xiàn)場(chǎng)不同站點(diǎn)的含油污泥，將生物降解菌、活化劑等按比例和油泥混拌均勻后，置于小試試驗(yàn)裝置中，按照第2.3節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法與流程，進(jìn)行生物降解試驗(yàn)。

試驗(yàn)過程中保持污泥溫度為20～35 ℃，培養(yǎng)20天后，取樣測(cè)定處理油泥內(nèi)部微生物數(shù)量，并檢測(cè)油泥除油率，數(shù)據(jù)如表2所列。

表2 生物活化劑及菌劑對(duì)不同站點(diǎn)污泥的降解效果Table 2 Degradation effect of biological activator and microbial agent on sludge at different sites污泥樣品來(lái)源w(原始污泥油)/%,干基w(處理后污泥油)/%,干基除油率/%平均除油率/%站點(diǎn)140.738.7178.61站點(diǎn)220.493.0385.21站點(diǎn)329.835.1682.70站點(diǎn)451.5210.6679.3081.46

表2數(shù)據(jù)表明：采用生物活化劑及菌劑處理，經(jīng)過20天生物降解，各站點(diǎn)污泥平均除油率81.46%；對(duì)于油含量相對(duì)較低的污泥(油含量20.49%)，除油率為85.21%。

3 修復(fù)試驗(yàn)與討論

3.1 植物與微生物體系對(duì)降解油泥的修復(fù)

油泥經(jīng)微生物降解后仍具有一定的生物毒性，利用特性植物可以修復(fù)和消除由有機(jī)毒物和無(wú)機(jī)廢物造成的土壤環(huán)境污染。植物在生長(zhǎng)過程中可直接或間接地吸收、分離或降解有機(jī)污染物，從而起到消除有機(jī)污染的作用。同時(shí)，植物生長(zhǎng)與土壤微生物存在密切的關(guān)系，植物生長(zhǎng)過程中根際的微生物也可和植物協(xié)同降解或固化有機(jī)污染物，植物與微生物的協(xié)同作用能明顯提高修復(fù)效果。

試驗(yàn)過程中，選擇站點(diǎn)2中3#原始油質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%(干重)經(jīng)過降解處理后油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～5%的污泥土壤作為修復(fù)試驗(yàn)對(duì)象。

修復(fù)過程不僅有利于促進(jìn)植物克服油泥土壤毒性完成適生性生殖，同時(shí)還能優(yōu)化土壤微生物類群，有助于促進(jìn)石油烴降解菌的活性發(fā)揮，增強(qiáng)植物-微生物的綜合降解效能。

3.1.1植物-微生物修復(fù)體系中適生植物的生長(zhǎng)情況

通過豆科、禾本科等9種不同類型植物品種，開展適生性篩選試驗(yàn)。

結(jié)果表明(見表3)，油泥土對(duì)多種篩選植物具有普遍生物毒性，但不同植物適應(yīng)程度不同。豆科植物的黃豆、黑豆、綠豆適生性較弱，其中綠豆在油泥土中具有一定的適生性，但其在降解油泥中不能生根，綠豆在油泥土中雖能生長(zhǎng)發(fā)芽，但生長(zhǎng)受到顯著抑制；禾本科的BB、AA、CC等植物的適生性較強(qiáng)，在降解油泥及優(yōu)化的油泥土中都能生根、發(fā)芽及生長(zhǎng)，其中以BB、AA適生性較強(qiáng)。

雙子葉植物篩選發(fā)現(xiàn)，十字花科的植物對(duì)油泥生物毒性最為敏感，在油泥土、降解油泥中均不能生根、發(fā)芽和生長(zhǎng)，可以作為生物毒性的指示植物。

而植物CC卻具有較強(qiáng)的耐受能力，在降解油泥和優(yōu)化的油泥土中均能生根、發(fā)芽和生長(zhǎng)。因此，選擇AA、BB、CC 3種植物作為降解油泥的種植修復(fù)植物。

表3 不同植物在降解油泥及優(yōu)化油泥土中的適生性篩選Table 3 Suitability screening of different plants in degrading oil sludge and optimizing oil sludge植物降解油泥油泥土生根發(fā)芽生長(zhǎng)適生性生根發(fā)芽生長(zhǎng)適生性DD++--+++++黃豆-----++-黑豆-----++-綠豆-+---+++苜蓿++--+++-AA++++++++++++++茼蒿-----+--CC+++++++++++BB++++++++++++++ 注: +表示適生程度,-表示抑制程度。

3.1.2不同修復(fù)體系和修復(fù)周期對(duì)石油烴降解效果分析

以標(biāo)準(zhǔn)原油為試樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到原油含量與吸光度的回歸方程：y=0.0434x+0.0005(R2=0.9946)，如圖8所示。

測(cè)定3種修復(fù)體系中第1次種植(30天)的油泥土原油含量從3.81%下降解到1.65%～2.33%，其中以AA體系降解效率最高。第2次種植后原油含量進(jìn)一步降低，降解效率最高為AA-促生菌體系，原油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.41%，如表4所列。

表4 不同修復(fù)周期油泥中含油率測(cè)定Table 4 Determination of oil content in oil sludge in different repair periods含油率/%處理第1次種植第2次種植BB體系2.061.55AA體系1.651.41CC體系2.331.62平均值2.051.56

4 結(jié)論

(1)利用分子生物學(xué)技術(shù)手段，在油田污水污泥中篩選出2種石油烴降解菌Yn-1和Yn-3，分別為短芽孢桿菌和賴氨酸芽孢桿菌，除油率分別達(dá)到22.7%和20.9%。

(2)開發(fā)的生物活化劑改善了原始污泥的物理性狀，增強(qiáng)了菌劑降解活性，通過20天強(qiáng)制生物降解處理后的污泥，平均除油率達(dá)到81.46%。

(3)對(duì)于w(含油)<20%的油田含油污泥，采用生物降解后，再經(jīng)過兩個(gè)周期的植物與微生物修復(fù)，污泥w(含油)<2%，油含量達(dá)到SY/T 7301-2016《陸上石油天然氣開采含油污泥資源化綜合利用及污染控制技術(shù)要求》的指標(biāo)要求，滿足井場(chǎng)道路鋪設(shè)用土要求。