張?jiān)婗?，?凡*，高 慧，曹麗娟，姜恒麗

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司，天津 300301)

中藥在中醫(yī)治療中起著重要作用，而不當(dāng)?shù)馁A藏與養(yǎng)護(hù)則會(huì)影響中藥的藥效[1]。中藥在不當(dāng)?shù)馁A藏過程中，如受不當(dāng)?shù)臏囟?、濕度、光線、藥材自身含水量、包裝方式等因素的影響，容易發(fā)生一系列質(zhì)變過程[2-3]。隨著中藥材市場規(guī)模的日益擴(kuò)大，中藥材正確的貯藏與養(yǎng)護(hù)變得十分關(guān)鍵，以便其充分發(fā)揮藥效以及避免發(fā)生安全問題[4]。人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根莖，味甘、微苦，微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，可大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智[5]。人參作為我國的名貴中藥材，在臨床中被廣泛應(yīng)用，但其用量不大且貯存周期長，不當(dāng)?shù)膬?chǔ)存方法會(huì)導(dǎo)致人參發(fā)生霉變、酸敗等現(xiàn)象，進(jìn)而影響其主要活性成分人參皂苷的含量[6]。因此本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜的方法，檢測人參皂苷Rg1、Re、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量變化，為人參的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；X/WT數(shù)顯調(diào)節(jié)儀電熱恒溫水浴鍋(余姚市顯星儀器有限公司)；Milli-Q型超純水制備儀(美國Millipore公司)；Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.2 材料

生曬參、鮮人參均購自于吉林白山林村盛實(shí)百草人參種植基地；人參皂苷Rg1(A0503AS)、人參皂苷Re(S0317AS)、人參皂苷Ro(F0214AS)、人參皂苷Rb1(D0718AS)、人參皂苷Rc(O0303AS)、人參皂苷Rb2(J0322AS)、人參皂苷Rd(D0105AS)，均購于美倫生物有限公司；乙腈、甲醇均為色譜級；其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 供試樣品制備

2.1.1 霉變?nèi)藚⒅苽?取未洗的鮮人參適量，不經(jīng)冷藏直接放置于室溫環(huán)境一段時(shí)間，直至鮮人參表面有白色絨毛斑點(diǎn)生成，每隔7日取出一批霉變的鮮人參，共4批。

2.1.2 酸敗生曬參制備 取生曬參適量，用濕抹布包裹，放置于室溫環(huán)境，放置一段時(shí)間后，聞到有酸敗氣味產(chǎn)生，每隔7日取出一批，共4批。

2.1.3 返軟生曬參制備 取生曬參適量，用水浸泡至生曬參變軟，取出。

2.1.4 鮮人參 取適量鮮人參，洗凈。

2.1.5 生曬參 取適量生曬參，備用。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2與人參皂苷Rd對照品適量，用30%乙腈定容，得到濃度分別為0.212 mg·mL-1，0.226 mg·mL-1，0.264 mg·mL-1，0.220 mg·mL-1，0.272 mg·mL-1，0.260 mg·mL-1，0.288 mg·mL-1的對照品溶液。搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品溶液制備[7]

取鮮人參、霉變?nèi)藚ⅰ⑺釘∩鷷駞⒁约胺弟浬鷷駞⑦m量切成碎末，分別精密稱取2.5 g；生曬參打粉，過4號(hào)篩，精密稱取1.0 g，各供試樣品分別用80%甲醇50 mL冷浸提取5次，每次12 h，40 ℃下濃縮提取液至干，用30%乙腈溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻放置，用前以0.45 μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，4 ℃下低溫儲(chǔ)藏。

2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，檢測波長：203 nm，流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：4 μL。梯度洗脫見表1，色譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序

A.人參皂苷混合對照品；B.人參供試品

(1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Ro；4.人參皂苷Rb1；5.人參皂苷Rc；6.人參皂苷Rb2；7.人參皂苷Rd)

圖1 人參皂苷混合對照品及人參供試品色譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下人參皂苷混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 μL，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x，μg)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以外標(biāo)曲線法，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果表明，各對照品進(jìn)樣量與峰面積在所選定的進(jìn)樣量范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

表2 人參皂苷各對照品線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)6次吸取混合對照品溶液進(jìn)超高效液相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd的峰面積積分RSD值依次為1.83%、1.33%、1.48%、1.85%、1.44%、1.48%、1.42%。說明該儀器精密度較好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取同一種樣品溶液，于放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣，結(jié)果表明人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd峰面積積分RSD依次為1.96%、1.67%、1.52%、1.54%、1.78%、1.56%、1.42%。說明樣品溶液中的7種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同時(shí)取出樣品6份，每一份精密稱取2.5 g，按照“2.3”項(xiàng)下制成樣品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下方法測定，得到人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd含量RSD值依次為1.50%、2.56%、2.40%、2.31%、2.34%、2.53%、2.11%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取生曬參粉末0.5 g，共9份，分為3組，精密加入低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度的7個(gè)對照品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9。

表3 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗(yàn)

表4 人參皂苷Re加樣回收率試驗(yàn)

表5 人參皂苷Ro加樣回收率試驗(yàn)

表6 人參皂苷Rb1加樣回收率試驗(yàn)

表7 人參皂苷Rc加樣回收率試驗(yàn)

表8 人參皂苷Rb2加樣回收率試驗(yàn)

表9 人參皂苷Rd加樣回收率試驗(yàn)

2.6 含量測定

精密稱取生曬參供試品1.0 g，其余各供試品2.5 g，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄7種人參皂苷的峰面積，計(jì)算7種人參皂苷的含量。

3 結(jié)果

對各人參樣品進(jìn)行測定，得到人參皂苷含量結(jié)果，見表10、表11。7種人參皂苷含量變化趨勢見圖2。結(jié)果顯示，霉變?nèi)藚⑾噍^于鮮人參，7種人參皂苷含量呈現(xiàn)上升趨勢；酸敗生曬參、返軟生曬參相較于生曬參，7種人參皂苷含量顯著下降，其中酸敗生曬參下降趨勢尤其明顯。

表10 鮮人參及不同程度霉變程度鮮人參中7種人參皂苷含量 (mg/g)

表11 生曬參、返軟生曬參及不同酸敗程度生曬參中7種人參皂苷含量 (mg/g)

圖2 7種人參皂苷含量趨勢變化

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人參發(fā)生霉變時(shí)，人參皂苷的含量相較于正常鮮人參的含量有所升高。但鮮人參在不當(dāng)?shù)臏囟扰c濕度環(huán)境下會(huì)引起霉變反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生，對人體產(chǎn)生危害。因此即使在皂苷含量升高的情況上，也應(yīng)該避免在儲(chǔ)存過程中發(fā)生霉變。我們可以在人參栽培過程中控制適當(dāng)?shù)臏囟纫约皾穸葋硎辊r人參中的人參皂苷含量保持相對較高的水平，以保證人參的藥效。

在生曬參與返軟生曬參以及酸敗程度不同的生曬參的對比中，生曬參相較于另外兩種貯存不當(dāng)?shù)纳鷷駞碚f，7種人參皂苷含量總和有明顯下降趨勢，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re以及人參皂苷Rb1的含量大幅度降低；且酸敗類型生曬參的人參皂苷含量明顯低于返軟類型生曬參。隨著酸敗程度的不斷加深，人參皂苷的含量逐漸下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將生曬參儲(chǔ)藏在濕度過高或濕度與溫度均過高的環(huán)境下，會(huì)導(dǎo)致生曬參發(fā)生返軟和酸敗現(xiàn)象，使其中人參皂苷含量明顯降低。因此在儲(chǔ)藏過程中應(yīng)該避免將生曬參放置于濕度與溫度過高的環(huán)境中，這樣可以使生曬參保持最高的人參皂苷含量，發(fā)揮最好的藥效，也可避免在變質(zhì)過程中產(chǎn)生有毒有害成分。

人參作為我國珍貴的中藥材越來越受人們重視，隨著其栽培與加工技術(shù)的不斷發(fā)展，人參在人們?nèi)粘Ｉ钆c臨床中得到廣泛應(yīng)用。不正確儲(chǔ)藏人參的方式會(huì)導(dǎo)致其有效活性成分人參皂苷的含量下降或產(chǎn)生有毒有害成分，使人參不能正確地發(fā)揮其滋補(bǔ)強(qiáng)壯以及預(yù)防治療疾病的功效[8]。因此，應(yīng)該對儲(chǔ)藏人參的溫度、濕度等環(huán)境條件進(jìn)行強(qiáng)化管理，這樣可以避免人參發(fā)生質(zhì)變，從而影響其藥材質(zhì)量[9]。