應(yīng)用FISH-AFLP技術(shù)分析105份櫻桃種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

陳新　徐麗　宗曉娟　王甲威　譚鉞　朱東姿　魏海蓉　洪坡　劉慶忠

摘要：為建立櫻桃種質(zhì)資源的FISH-AFLP技術(shù)體系并進(jìn)行親緣關(guān)系分析，本研究以國內(nèi)外搜集的105份櫻桃種質(zhì)為對(duì)象，經(jīng)DNA提取、EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，再進(jìn)行FISH-AFLP反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)果顯示，篩選得到8對(duì)EcoRⅠ/MseⅠ多態(tài)性引物，可擴(kuò)增出1 148條譜帶，平均多態(tài)性比率98.61%。聚類分析和遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，105份櫻桃栽培品種的遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.89，當(dāng)閾值為0.68時(shí)，可分成7個(gè)AFLP群;有效等位基因數(shù)、基因多樣度、Shannon信息指數(shù)分別為1.52、0.30、0.45，具有較高的遺傳多樣性。本研究結(jié)果可為今后櫻桃品種鑒別和遺傳多樣性研究等提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：櫻桃;FISH-AFLP;遺傳多樣性;親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)：S662.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）11-0022-06

Genetic Relationship Analysis of 105 Accessions of

Cherry Germplasms by FISH-AFLP Technology

Chen Xin， Xu Li， Zong Xiaojuan， Wang Jiawei， Tan Yue，

Zhu Dongzi， Wei Hairong， Hong Po， Liu Qingzhong

（Shandong Institute of Pomology/Shandong Provincial Key Laboratory of

Fruit Tree Biotechnology Breeding， Taian 271000， China）

Abstract The objective of this study was to establish FISH-AFLP analysis system for cherry and analyze the genetic relationship of the main cultivars. One hundred and five cherry cultivars were selected as experiment materials. The high-quality genomic DNA was extracted and the purified DNA samples were digested with EcoRⅠ/MseⅠ;after ligation reaction， the samples were used to perform FISH-AFLP detection. The amplification results showed that eight pairs of EcoRⅠ/MseⅠ polymorphic primers were screened and 1 148 bands were obtained. The average percentage of polymorphic bands was 98.61%. The results of cluster analysis and genetic diversity analysis showed that the genetic similarity coefficient of the 105 cherry cultivars varied from 0.54 to 0.89. All the samples were divided into 7 groups when the threshold value was 0.68. The numbers of effective alleles， gene diversity and Shannon information index of the main cultivars were 1.52， 0.30 and 0.45， respectively， indicating high genetic diversity. This study could provide theoretical guidance for the identification and genetic diversity research of cherry varieties in the future.

Keywords Cherry; FISH-AFLP; Genetic diversity; Genetic relationship

櫻桃為多年生木本果樹，屬薔薇科櫻桃屬。目前世界上作為果樹栽培的櫻桃有4個(gè)種，品種繁多，僅栽培品種就超過2 000個(gè)。隨著我國新品種的不斷選育以及國外品種的引進(jìn)，基于表型性狀標(biāo)記鑒定不同品種以及確定品種分類地位及相互之間的親緣關(guān)系越來越困難。DNA分子標(biāo)記在櫻桃上的應(yīng)用已有報(bào)道。其中，RAPD[1-3]、SSR[4，5]皆曾用于櫻桃種質(zhì)資源的研究，但揭示的多態(tài)性位點(diǎn)較少;國外研究者曾利用cpSCAR分析櫻桃品種間的遺傳關(guān)系和多樣性[6]，但多集中在親緣關(guān)系較近的歐洲甜櫻桃品種上，尤其是一些老品種。

AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）檢測DNA多態(tài)性的方法，于1995年以論文形式發(fā)表[7]，是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長度檢測DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP具有多態(tài)性強(qiáng)、譜帶豐富和靈敏、分辨率高、快速高效、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是一種較為理想的分子標(biāo)記技術(shù)[8]，可用于檢測種及種以下水平上的差異。目前，科研人員已利用AFLP技術(shù)進(jìn)行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、抗病連鎖基因分析和品種親緣關(guān)系等研究[9-11]。而帶有熒光標(biāo)記的FISH-AFLP技術(shù)在各種生物的遺傳多樣性分析、分子鑒定和群體遺傳結(jié)構(gòu)等研究中也得到廣泛應(yīng)用[12-17]，但該技術(shù)應(yīng)用于櫻桃資源的研究未見報(bào)道。基于此，本試驗(yàn)利用FISH-AFLP技術(shù)標(biāo)記對(duì)櫻桃種質(zhì)進(jìn)行研究，并對(duì)遺傳多樣性的重要度量指標(biāo)——有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）及Shannon信息指數(shù)（I）進(jìn)行分析，旨在建立櫻桃種質(zhì)FISH-AFLP分子標(biāo)記的方法，并為品種鑒別、親緣關(guān)系劃分和遺傳多樣性研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品為105份櫻桃種質(zhì)資源（表1），均種植于山東省果樹研究所櫻桃品種資源圃。于2018年4月采集樹體中上部新鮮嫩葉，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 櫻桃基因組DNA制備及酶切反應(yīng)

采用改良CTAB法[18]提取葉片基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。

酶切和連接反應(yīng)在同一反應(yīng)中進(jìn)行?？傮w系20 μL：10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL、AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL、EcoRⅠ/MseⅠAdaptor（10 μmol/L） 各1 μL、模板DNA 5 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL?；靹螂x心數(shù)秒，25℃保溫5 h。

1.3 AFLP分析

利用編號(hào)為4、25、26和91的樣本，從64對(duì)AFLP EcoRⅠ/MseⅠ引物中篩選出擴(kuò)增圖譜清晰的8對(duì)引物：E41M56、E49M62、E44M58、E33M84、E59M72、E33M48、E38M86和E40M48（表2）。

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL，其中包括酶切-連接模板DNA 4 μL，2×PCR Mix 10 μL，EcoR Ⅰ和MseⅠ引物（20 μmol/L）各1 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min;4℃保存。預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍作為選擴(kuò)模板，選擇性擴(kuò)增總體系20 μL，其中包括預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品 2 μL，2×PCR Mix 10 μL，EcoRⅠ和5′端帶有熒光標(biāo)記的MseⅠ引物（20 μmol/L，表2）各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min;95℃ 35 s，65℃ 35 s，72℃ 1 min，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增12輪; 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃保存。

將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板，再加入1 μL稀釋10倍的上述PCR產(chǎn)物。使用3730XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GeneMarker 1.8 軟件將測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將電泳圖轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣，即有帶記為1，無帶記為0;用軟件NTSYS-pc 2.11對(duì)所得數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖;用軟件Popgene 1.32計(jì)算樣品遺傳多樣性的度量指標(biāo)——有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）及 Shannon 信息指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物組合 FISH-AFLP 擴(kuò)增的多態(tài)性比較[HTSS]

由表3可以看出，8對(duì)引物共擴(kuò)增得到1 148條譜帶，平均每對(duì)引物產(chǎn)生143.5條譜帶，多態(tài)性譜帶1 132條，平均多態(tài)性比率98.61%。不同引物組合在擴(kuò)增帶數(shù)、帶型、條帶分布均勻度等方面皆有所差異。其中，引物組合E33M84和 E41M56多態(tài)性比例達(dá)到100%，其它引物組合的多態(tài)性比例也在95%以上。圖1為引物組合E40M48對(duì)所有樣品的擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 105份櫻桃種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

2.2.1 遺傳相似性系數(shù) [HTSS]105份櫻桃種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.89，平均值為0.72。其中桑緹娜和Stella的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.89，親緣關(guān)系較近;哥倫比亞和毛櫻桃2號(hào)以及尤巨和M16之間的遺傳相似性系數(shù)最小，均為0.54，表明品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2.2 聚類分析 [HTSS]在相似系數(shù)0.68處做結(jié)合線，該線將試驗(yàn)樣品分成7個(gè)AFLP群（AFLP Groups，簡稱 AG）：AG1含有1個(gè)品種，即灰毛葉櫻桃;AG2含有3個(gè)品種，即大青葉、泰山紅櫻和泰山干櫻;AG3含有1個(gè)品種，即東北紅櫻; AG4含有5個(gè)品種，即多毛櫻桃、馬哈利×草原櫻桃、馬哈利實(shí)生后代、M16和奧德; AG5含有17個(gè)品種，即六倍體（吉塞拉）、B5、六倍體實(shí)生、草原櫻桃、美麗、SC1、ZY-1、SC6、SC4、早生、SDL-1、聶美人、colt、東塘、短枝櫻桃、F8和艾雜; AG6含有1個(gè)品種，即毛櫻桃2號(hào);AG7中含有其它77個(gè)品種。

2.2.3 遺傳多樣性分析 [HTSS]根據(jù)數(shù)據(jù)矩陣計(jì)算不同引物組合的遺傳多樣性度量指標(biāo)（表4），進(jìn)行遺傳多樣性分析。8對(duì)引物檢測到樣品不同位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)為1.43～1.57，平均為1.52;基因多樣度為0.26～0.32，平均為0.30;Shannon信息指數(shù)為0.39～0.48，平均為0.45。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用FISH-AFLP方法，對(duì)105個(gè)櫻桃種質(zhì)資源進(jìn)行多樣性分析，選用的8對(duì)引物組合共產(chǎn)生1 148條譜帶，平均每對(duì)引物產(chǎn)生143.5條譜帶，其中，多態(tài)性譜帶1 132條，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)高達(dá)98.61%。該方法得到的譜帶數(shù)與其它樹種FISH-AFLP所獲數(shù)值相近[19，20]，高于普通銀染AFLP所獲譜帶數(shù)[17-21]。由此可見，作為一種新型的分子標(biāo)記，F(xiàn)ISH-AFLP技術(shù)在櫻桃資源的系統(tǒng)分類、親緣關(guān)系鑒定、品種鑒別、親本選擇等方面具有潛在的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)確立的FISH-AFLP體系、篩選的引物組合及所得親緣關(guān)系和遺傳多樣性等數(shù)據(jù)均可為后續(xù)相關(guān)研究提供參考，對(duì)其它物種的AFLP研究也有一定的參考價(jià)值。

本研究通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，蘇1號(hào)、泰山紅日和泰山朝陽櫻桃品種聚在一亞類，體現(xiàn)了它們較近的親緣關(guān)系，說明具有相同的遺傳背景。這與三者是從那翁為母本、大紫為父本雜交產(chǎn)生的實(shí)生群體中選育出的優(yōu)良品種的事實(shí)相符合。另外，吉塞拉6號(hào)和吉塞拉7號(hào)是灰毛葉櫻桃和酸櫻桃雜交育成的優(yōu)良櫻桃砧木，具有矮化、抗性強(qiáng)、嫁接親和性好等特點(diǎn)。Y1是從吉塞拉6號(hào)自然受粉獲得的種子后代中篩選出的四倍體新種質(zhì)，Y1和吉塞拉6號(hào)親緣關(guān)系較近，優(yōu)先聚在一起，然后再與吉塞拉7號(hào)聚集。

評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)包括有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）和Shannon指數(shù)（I）。本研究得到的遺傳多樣性參數(shù)為Ne=1.52，H=0.30，I=0.45。本試驗(yàn)對(duì)櫻桃主栽品種進(jìn)行研究，其遺傳相似系數(shù)為0.54～0.89，平均為0.72。由于研究樣品中既有歐洲引進(jìn)的甜櫻桃（Prunus avium L.）品種，又有酸櫻桃（P. cerasus L.）、中國櫻桃（P. pseudocerasus LindI.）、雜交品種和野生櫻桃屬植物，所處環(huán)境和地域較廣，而櫻桃的種植年限長，遺傳背景豐富，因此遺傳相似系數(shù)閾值范圍比較大。

參 考 文 獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-06-10

基金項(xiàng)目：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2016YQN25）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-04） ;科技部科技基礎(chǔ)平臺(tái)項(xiàng)目（NICGR2018-048）

作者簡介：陳新（1980—），男，博士，副研究員，主要從事果樹種質(zhì)資源與分子生物學(xué)研究。E-mail： sdaucx@163.com

通訊作者：劉慶忠（1963—），男，博士，研究員，研究方向：果樹種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種。E-mail： qzliu001@126.com

徐麗（1983—），女，博士，助理研究員，主要從事果樹種質(zhì)資源和分子生物學(xué)研究。E-mail： xuli1245@ 163.com