李逸豪，石冰潔，馮婭茹，李曉瑞，朱晶晶，田金洲，時(shí) 晶，倪敬年，王建勛

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京102400；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院)

聚集素(CLU)基因是單拷貝基因，位于第八號(hào)染色體短臂8p21-12上，長度約16 kb，由8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子組成。其表達(dá)產(chǎn)物聚集素蛋白(Clusterin)又稱載體蛋白J,僅次于載體蛋白E，為人腦第二大糖蛋白[1]。它的生物學(xué)功能與載體蛋白E相似，促進(jìn)Aβ淀粉樣蛋白的聚集，介導(dǎo)Aβ的清除，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、神經(jīng)炎性反應(yīng)及補(bǔ)體反應(yīng)[2]。多項(xiàng)研究表明，AD患者海馬區(qū)和額葉皮層有Clusterin表達(dá)的增加[3]。2009年全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，CLU的染色體定位區(qū)是AD易感相關(guān)區(qū)域，并且認(rèn)為CLU基因上的SNP位點(diǎn)與遲發(fā)性老年癡呆(LOAD)發(fā)病相關(guān)[4]。故CLU基因上的SNP位點(diǎn)與AD的相關(guān)性研究成為熱點(diǎn)。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。因每個(gè)SNP位點(diǎn)通常僅含兩個(gè)等位基因，在檢測時(shí)能通過一個(gè)簡單的“+/-”分析進(jìn)行基因型分型，無需分析片段長度[5]。故本實(shí)驗(yàn)根據(jù)AS-PCR原理設(shè)計(jì)特異性的引物，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，通過QPCR對SNP位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，以確定SNP位點(diǎn)的基因型。該方法將用于后續(xù)臨床CLU基因與AD相關(guān)SNP位點(diǎn)基因型的檢測，為探尋AD的易感基因提供一種簡單、便捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本13例血液樣本均來自2018年北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院的門診或住院患者。其中男性8人，女性5人，所有研究對象簽署書面知情同意書同意后，采集外周血2 ml，并保存在-20℃冰箱。正常組3例，為健康且無AD家族遺傳史者，其余10例血液樣本均來自AD患者。

1.3 方法

1.3.1基因組DNA的提取 基因組的提取參考QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書進(jìn)行。提取的核酸利用超微量分光光度儀測定DNA的含量，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2特異性引物的設(shè)計(jì) 從Genbank中下載CLU全基因序列及待測SNP位點(diǎn)的信息，使用primer Premier 5.0軟件對3個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物。針對SNP位點(diǎn)rs11136000設(shè)計(jì)3對特異性引物，外側(cè)引物用于常規(guī)PCR擴(kuò)增及測序，2對內(nèi)側(cè)引物用來鑒別rs11136000基因的3種基因型(CC型、CT型、TT型)。針對SNP位點(diǎn)rs2279590設(shè)計(jì)3對特異性引物，外側(cè)引物用于常規(guī)PCR擴(kuò)增及測序，2對內(nèi)側(cè)引物用來鑒別rs2279590基因的3種基因型(CC型、CT型、TT型)。針對SNP位點(diǎn)rs9331888設(shè)計(jì)3對特異性引物，外側(cè)引物用于常規(guī)PCR擴(kuò)增及測序，2對內(nèi)側(cè)引物用來鑒別rs9331888基因的3種基因型(CC型、CG型、GG型)。引物序列見下表1。

表1 SNP位點(diǎn)常規(guī)PCR和QPCR引物序列

1.3.3基因測序分型 使用設(shè)計(jì)的常規(guī)PCR引物及TaqTMHotStar DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系組成如下：10 ×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture(2.5 mM)2 μl，TaKaRa Taq酶(5 U/μl)0.125 μl，上下游引物(10 μM)各1 μl，DNA模板1 μl，滅菌水17.375 μl，反應(yīng)總體系25 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析，DL2000 DNA marker作為參考，回收并純化所需DNA條帶，送由上海生物工程公司完成測序。

1.3.4陽性對照組質(zhì)粒模板的構(gòu)建 使用北京市東直門醫(yī)院采集的3例健康者的血液作為樣本，從血液中提取基因組DNA，按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收所需DNA條帶并送測，PCR產(chǎn)物作為模板構(gòu)建質(zhì)粒載體。因s11136000， rs2279590 和 rs9331888 位點(diǎn)各對應(yīng)2種堿基，3種基因型。故根據(jù)測序結(jié)果，以已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒載體為模板進(jìn)行點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，獲得每個(gè)SNP位點(diǎn)相對應(yīng)的另一種堿基，并構(gòu)建新的質(zhì)粒載體。將已經(jīng)構(gòu)建好的兩種純合子質(zhì)粒載體等比例混合，獲得雜合質(zhì)粒載體，從而構(gòu)建符合各SNP位點(diǎn)基因型的陽性對照組質(zhì)粒模板。載體的構(gòu)建使用PCR產(chǎn)物作為模板，pMDTM18-T Vector(TaKaRa)作為載體，步驟參考TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit說明書。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)采用已經(jīng)測序的質(zhì)粒載體作為模板，點(diǎn)突變引物自行設(shè)計(jì)，選擇QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit中的PCR反應(yīng)試劑，PCR反應(yīng)體系組成如下：10×reaction Buffer 5 μl，dNTP Mixture 1 μl，上下游突變引物(10 μM)各1 μl，QuickSolution reagent 1.5 μl，質(zhì)粒DNA模板 1 μl，滅菌水14.5 μl，隨后加入Quickchange lightening Enzyme 1 μl，反應(yīng)總體系26 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 20 s，60℃ 10 s，68℃ 30 s，共18個(gè)循環(huán)；終延伸68℃ 5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物根據(jù)說明書構(gòu)建質(zhì)粒載體。

1.3.5QPCR定量分型 采用設(shè)計(jì)的QPCR引物，選擇SYBR Green qPCR Master進(jìn)行QPCR檢測。QPCR反應(yīng)體系組成如下：2×SYBR Green Master Mix 10 μl，上下游引物(10 μM)1 μl，DNA模板 1 μl，滅菌水 7 μl，反應(yīng)總體系 25 μl。rs11136000、rs9331888擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃ 2 min，95℃ 5 s，64℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。rs2279590擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃ 2 min，95℃ 5 s，55℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。將實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組所得結(jié)果進(jìn)行比較，對各組臨床樣本進(jìn)行SNP分型。

1.3.6基因型判讀 QPCR實(shí)驗(yàn)前對每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)4個(gè)不同梯度的DNA模板(109copies、108copies、107copies、106copies)陽性對照組。因1個(gè)SNP位點(diǎn)有3種基因型，2對特異性引物，故每個(gè)SNP位點(diǎn)共有6種不同的基因型和引物組合。其中引物與所對應(yīng)的純合基因型質(zhì)粒模板為陽性對照組，引物與非對應(yīng)的純合基因型質(zhì)粒模板為非特異性組，引物與混合基因型質(zhì)粒模板為混合組。反應(yīng)結(jié)束后，以ct值為橫坐標(biāo)，特異性引物與相對應(yīng)的純合子基因型組起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(相關(guān)系數(shù)R2>0.99)。通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線將混合組和非特異性組ct值等比例換算成copies，換算結(jié)果按純合基因型/純合基因型，雜合基因型/雜合基因型比較，所得結(jié)果按倍率形式體現(xiàn)，再將倍率按logistic對數(shù)形式轉(zhuǎn)換，并對結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)陽性對照組QPCR結(jié)果得到所需的SNP位點(diǎn)基因型判讀區(qū)間為：對于rs11136000,當(dāng)結(jié)果落在[1,+∞]時(shí)基因型為CC;[-1,1]基因型為CT;[-1,-∞]基因型為TT。對于rs2279590,當(dāng)結(jié)果落在[1,+∞]時(shí)基因型為CC;[-1,1]基因型為CT;[-1,-∞]基因型為TT。對于rs9331888,當(dāng)結(jié)果落在[1,+∞]時(shí)基因型為CC;[-1,1]基因型為CG;[-1,-∞]基因型為GG。各SNP位點(diǎn)基因型判讀區(qū)間如圖1。

注：rs11136000(A),rs2279590(B)上層區(qū)間代表CC,中層區(qū)間代表CT,下層區(qū)間代表TT；rs9331888(C)上層區(qū)間代表CC,中層區(qū)間代表CG,下層區(qū)間代表GG

圖1 rs11136000(A)位點(diǎn)，rs2279590(B)位點(diǎn) 和 rs9331888(C)位點(diǎn)基因型判讀示意圖

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的提取10例AD患者的外周血采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，經(jīng)超微量分光光度儀檢測吸光度(A)，A260 nm/A280 nm比值均在1.8-2.0之間，表明提取DNA純度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 基因測序法和QPCR定量分型法結(jié)果比較對10組樣本的rs11136000，rs2279590和rs9331888 3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因測序和QPCR定量分型結(jié)果如圖2，圖3，圖4所示。兩種方法檢測10例樣本rs11136000，rs2279590 和 rs9331888位點(diǎn)基因型的符合率為100%，結(jié)果見表2，表3，表4。

表2 兩種方法檢測rs11136000基因型分布(n=10)

表3 兩種方法檢測rs2279590基因型分布(n=10)

表4 兩種方法檢測rs9331888基因型分布(n=10)

注：①，②是基因測序法檢測結(jié)果，基因型分別為CC,CT;③是QPCR定量分型法結(jié)果，上層的點(diǎn)代表基因型CC,中層的點(diǎn)代表CT

3 討論

單核苷酸多態(tài)性是一種遺傳標(biāo)記，位于人類基因組上[6]。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人們發(fā)現(xiàn)人類的DNA序列并非完全一致的，其中包含著某些變異[7]。這些變異導(dǎo)致了多種遺傳性疾病的產(chǎn)生。作為第三代遺傳標(biāo)志， SNP 位點(diǎn)與遺傳性疾病的產(chǎn)生息息相關(guān)[8]。故對 SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究及檢測，將為發(fā)現(xiàn)遺傳疾病高危群體、檢測疾病的相關(guān)基因以及對生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究等方面提供一條新的出路。現(xiàn)有的SNP 的檢測方法大致可以分為兩大類[9]：一大類是以單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異性 PCR(AS-PCR)等為代表的以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法。另一大類是以直接測序、質(zhì)譜檢測技術(shù)等為代表的高通量、自動(dòng)化程度較高的檢測方法。多種檢測方法中直接測序法準(zhǔn)確度最高，常作為SNP位點(diǎn)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。但該方法所需儀器成本高，測序耗時(shí)較長，很難在一般性醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室中普及。而AS-PCR法既不需要昂貴的檢測儀器，也沒有冗雜的實(shí)驗(yàn)過程，僅需設(shè)計(jì)特異性的引物，結(jié)合QPCR技術(shù)，即可實(shí)現(xiàn)對待測基因的SNP位點(diǎn)的高通量測序。故AS-PCR技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究中檢測基因SNP位點(diǎn)的主要技術(shù)。

聚集素最早由Blaschuk等[11]在1983年從山羊睪丸網(wǎng)液(Ram fete testis fluid)中分離出來，因其可

注：①，②是基因測序法檢測結(jié)果，基因型分別為CC,CT;③是QPCR定量分型法結(jié)果，上層的點(diǎn)代表基因型CC,中層的點(diǎn)代表CT

注：①，②，③是基因測序法檢測結(jié)果，基因型分別為CC,CG,GG;④是QPCR定量分型法結(jié)果，上層的點(diǎn)代表基因型CC,中層的點(diǎn)代表CG,

以介導(dǎo)支持細(xì)胞的聚集而得名。過往研究顯示，聚集素蛋白在很多神經(jīng)變性疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)，該蛋白與神經(jīng)變性疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系。而AD就是一種常見的中樞神經(jīng)變性疾病[12]。Rehrmann等[13]研究的全部 AD患者中，有29%的患者腦實(shí)質(zhì)中β淀粉樣蛋白的沉積量與聚集素蛋白含量呈正相關(guān)，他們認(rèn)為聚集素可能在變性細(xì)胞內(nèi)部和周圍表達(dá)中起保護(hù)作用。而 Nuutinen 等[14]則認(rèn)為細(xì)胞核中的聚集素蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，雖然聚集素蛋白對腦組織有保護(hù)作用，但無法阻止AD患者慢性神經(jīng)性病變的發(fā)生。然而，早期關(guān)于CLU基因多態(tài)性與AD的相關(guān)性研究，并未發(fā)現(xiàn)與AD相關(guān)的位點(diǎn)。此外，兩項(xiàng)對AD轉(zhuǎn)基因鼠PDAPP進(jìn)行CLU基因敲出實(shí)驗(yàn)的研究[15]中發(fā)現(xiàn)，在Aβ沉積相似的情況下，纖維樣淀粉樣蛋白沉淀的減少，神經(jīng)炎性反應(yīng)減輕，腦內(nèi)可溶性Aβ的水平有所改變。但另一方面，聚集素蛋白不表達(dá)反而會(huì)加速Aβ的沉積。這說明CLU表達(dá)在AD發(fā)病中的作用比較復(fù)雜。直到2009年歐洲兩項(xiàng)大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)性研究[4]發(fā)現(xiàn)，CLU基因是LOAD的潛在易感基因，其染色體定位區(qū)為AD的易感性區(qū)域。這使得CLU基因多態(tài)性與AD的關(guān)聯(lián)性成為研究的大熱。

歐洲兩項(xiàng)大樣本病例對照研究[16,17]證明，CLU基因中的3個(gè)SNP位點(diǎn)(rs11136000，rs2279590 和 rs9331888)與高加索人群發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Jun G等[18]對多個(gè)研究中心(美國、加拿大、以色列)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析,證明CLU與AD相關(guān)。只有一項(xiàng)歐洲病例對照研究[19]未發(fā)現(xiàn)CLU與AD相關(guān)的常見突變。一項(xiàng)俄羅斯的病例研究[20]表明，在非高加索人群中CLU rs11136000在兩組間分布無差異。一項(xiàng)在中國北方漢族人群中進(jìn)行的病例對照研究[21]，雖然未發(fā)現(xiàn)CLU rs11136000與LOAD的關(guān)聯(lián)性，但發(fā)現(xiàn)CLU基因另一個(gè)位點(diǎn)rs9331888的等位基因G會(huì)增加發(fā)生LOAD的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)rs2279590-rs11136000-rs9331888構(gòu)成的單體型CCG會(huì)增加LOAD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)性，單體型CCC則會(huì)降低LOAD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)性。綜上研究可以發(fā)現(xiàn)，CLU基因的多態(tài)性存在種族差異。CLU與LOAD的相關(guān)性在高加索人群中已基本得以證實(shí)。而在非高加索人群中,有可能存在其它的相關(guān)關(guān)系,值得進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)基于AS-PCR技術(shù)，成功構(gòu)建了一種用于CLU基因上rs11136000，rs2279590和rs9331888 3個(gè)SNP位點(diǎn)的QPCR定量分型檢驗(yàn)方法,該方法檢測的結(jié)果和基因測序所得結(jié)果完全一致。對于非高加索人群，CLU基因多態(tài)性與AD的相互關(guān)系仍需更多的臨床樣本進(jìn)行研究。而相對于價(jià)格昂貴，操作繁瑣的基因測序法，該方法具有更加快捷、便宜的優(yōu)勢，真正實(shí)現(xiàn)了對這些SNP位點(diǎn)高通量和低成本的檢測。從而為后續(xù)CLU基因多態(tài)性與AD的相互關(guān)系研究提供了便利。