孫亦鵬 倪振華 吳穎穎 陳清閣 畢俊杰 林玉華 王雄彪

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，而化療藥物耐藥是臨床治療肺癌療效不佳的關(guān)鍵問題[1]。因此，尋找耐藥基因、研究其潛在的機(jī)制，進(jìn)而靶向治療是一種合理的思路方法。唇腭裂跨膜蛋白1樣蛋白(Cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L)與耐藥密切相關(guān)。該基因最初是在篩查順鉑耐藥相關(guān)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的，因此又稱為CRR9(Cisplatin resistance related protein，CRR9)，其在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CLPTM1L在肺癌中的表達(dá)顯著增加，并且其表達(dá)量與肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和喜樹堿的敏感性相關(guān)[3-4]。吉西他濱是治療肺癌的一線化療藥物，常用于聯(lián)合鉑類等抗癌藥物治療肺癌，臨床療效顯著。為此本研究以肺癌細(xì)胞95-D為研究對(duì)象，觀察CLPTMIL基因表達(dá)變化與肺癌細(xì)胞吉西他濱敏感性的關(guān)系，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司；Caspase-3/7和Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；CCK-8試劑購(gòu)自同仁化學(xué)公司；蛋白裂解液購(gòu)自Thermo公司；CLPTM1L抗體購(gòu)自Novus、Santa公司；p-4E-BP1抗體、β-actin抗體購(gòu)自CST公司；吉西他濱購(gòu)自Selleck公司；肺癌95-D細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肺癌細(xì)胞95-D培養(yǎng) 人95-D肺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液。

1.2.2 CLPTM1L基因過表達(dá)慢病毒制備及感染 由上海吉?jiǎng)P公司克隆CLPTM1L基因的編碼區(qū)序列，構(gòu)建病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備慢病毒顆粒。培養(yǎng)95-D細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種于24孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，在polybrene(濃度5 mg/L)存在的條件下分別以感染復(fù)數(shù)(MOI)=100的慢病毒感染細(xì)胞，感染72 h后收集細(xì)胞，通過有限稀釋法篩選單克隆，以成功感染的單克隆細(xì)胞為CLPTM1L過表達(dá)組，以正常95-D細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)CLPTM1L mRNA表達(dá)水平 采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照SuperScript III試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Roche熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)CLPTM1L mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)條件為：94℃ 10 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物序列見表1。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CLPTM1L蛋白表達(dá) 收集95-D CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞，以每孔7 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后吸棄孔內(nèi)上清液，加入4%多聚甲醛固定10 min，然后用含0.1% Triton X-100的PBS溶液清洗3次，加入CLPM1L抗體4℃孵育過夜，之后用含0.1% Triton X-100的PBS溶液清洗3次，加入熒光二抗于37℃溫箱放置1 h，加入DAPI進(jìn)行核染色，最后在熒光顯微鏡下觀察。

表1 引物序列表

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集95-D CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞，以每孔7 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，分別加入不同濃度吉西他濱(0 nM、2.5 nM、5 nM和10 nM)處理細(xì)胞48 h，之后吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，選擇450 nm波長(zhǎng)在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光光度值。

1.2.6 Caspase-3/7和Caspase-9活性檢測(cè) 收集95-D CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞，以每孔7 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，分別加入不同濃度吉西他濱(0 nM、2.5 nM、5 nM和10 nM)處理細(xì)胞48 h，每孔加入100 μL Caspase-3/7或Caspase-9底物，混合孵育3 h后采用Promega GloMax 20/20發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光光度值。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)變化 取等量蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST+5%BSA封閉液封閉2 h。將膜分別與CLPTM1L、p-4E-BP1、β-actin一抗4℃孵育過夜，然后TBST洗滌3次，每次10 min，之后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗，室溫孵育2 h。用TBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL發(fā)光液，于Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CLPTM1L過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建

用CLPTM1L過表達(dá)慢病毒感染肺癌95-D細(xì)胞，將細(xì)胞分為CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CLPTM1L過表達(dá)組CLPTM1L mRNA(12.42±6.40，P=0.036)顯著增高；Western blot和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，過表達(dá)組CLPTM1L蛋白高于對(duì)照組(P<0.01)(圖1)。

圖1 慢病毒感染95-D后CLPTM1L mRNA和蛋白表達(dá)變化

2.2 CLPTM1L過表達(dá)對(duì)吉西他濱抑制95-D細(xì)胞增殖的影響

CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，在對(duì)照組內(nèi)，與吉西他濱0 nM組相比，2.5、5和10 nM組的細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.01)；與對(duì)照組相比，CLPTM1L過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力顯著升高(P<0.01)(圖2)。說明CLPTM1L過表達(dá)后抑制了吉西他濱對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用。

圖2 吉西他濱處理CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞后細(xì)胞增殖的變化

2.3 CLPTM1L過表達(dá)對(duì)吉西他濱激活95-D細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/7和Caspase-9的影響

本研究檢測(cè)了吉西他濱作用于CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/7和Caspase-9的激活情況。結(jié)果顯示，在對(duì)照組內(nèi)，與0 nM組相比，吉西他濱2.5、5、10 nM組的Caspase-3/7和Caspase-9活性顯著增高(P<0.01)；與對(duì)照組相比，CLPTM1L過表達(dá)組的Caspase-3/7和Caspase-9活性顯著降低(P<0.01)(圖3)。說明CLPTM1L過表達(dá)后抑制了吉西他濱誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。

2.4 CLPTM1L過表達(dá)對(duì)p-4E-BP1的影響

研究表明，真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor 4E(eIF4E)-binding protein 1，4E-BP1)在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[5]。因此本研究檢測(cè)了CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)4E-BP1的磷酸化狀態(tài)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CLPTM1L過表達(dá)組p-4E-BP1表達(dá)水平顯著升高(3.41±0.22，P<0.01)(圖4)。

圖3 吉西他濱敏作用于CLPTM1L過表達(dá)組和對(duì)照組后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/7和Caspase-9活性的變化

圖4 CLPTM1L過表達(dá)對(duì)p-4E-BP1的影響

3 討論

CLPTM1L基因位于人染色體5p15.33，其與肺癌的關(guān)系最初是在肺癌的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide association study，GWAS)中發(fā)現(xiàn)的。2008年McKay等[6]報(bào)道了一項(xiàng)關(guān)于肺癌的GWAS研究，他們的研究結(jié)果指出5p15.33區(qū)域上的rs402710位點(diǎn)(CLPTM1L基因第9內(nèi)含子)是肺癌的易感位點(diǎn)，可顯著增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)英國(guó)的學(xué)者發(fā)現(xiàn)CLPTM1L基因內(nèi)另一位點(diǎn)rs401681的多態(tài)性與肺癌發(fā)病相關(guān)[7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者也證實(shí)在中國(guó)人中CLPTM1L是肺癌預(yù)后不良的標(biāo)志物[8-10]。之后越來越多的報(bào)道揭示CLPTM1L是一個(gè)重要的肺癌易感基因[11]。然而，盡管已經(jīng)證實(shí)CLPTM1L與肺癌密切相關(guān)，但是關(guān)于CLPTMIL的功能研究并不多。最初被發(fā)現(xiàn)時(shí)報(bào)道CLPTM1L與卵巢癌中順鉑耐藥有關(guān)[2]。Ni等[3]研究發(fā)現(xiàn)CLPTM1L的表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性相關(guān)。近年來，Clarke等[12]也發(fā)現(xiàn)CLPTM1L的高表達(dá)可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，CLPTM1L過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)吉西他濱對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制、抑制吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的激活。因此過表達(dá)CLPTM1L可降低95-D肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，而影響癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感性很可能就是CLPTM1L基因的主要功能。

對(duì)CLPTM1L調(diào)節(jié)腫瘤耐藥機(jī)制的深入探究可使得靶向CLPTM1L的藥物開發(fā)、進(jìn)而為臨床服務(wù)成為可能。近年來，4E-BP1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和化療藥耐藥中的重要作用日益受到關(guān)注。在非小細(xì)胞肺癌中，4E-BP1的高磷酸化均與高侵襲性、低生存率顯著相關(guān)[13]。Roh等[14]亦發(fā)現(xiàn)p-4E-BP1在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，并且其與胞質(zhì)p-AKT可作為肺癌不良預(yù)后的重要指標(biāo)。4E-BP1還是PI3K/Akt/mTOR通路下游的靶分子之一，而AKT/mTOR的異常激活是一種重要的致癌機(jī)制[16]。此外，4E-BP1與腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性關(guān)系密切。在前列腺癌細(xì)胞中，4E-BP1低表達(dá)的細(xì)胞對(duì)藥物MLN0128(mTOR抑制劑)更敏感，而在耐藥的前列腺癌細(xì)胞中下調(diào)4E-BP1的表達(dá)可增加細(xì)胞對(duì)MLN0128的敏感性；抑制4E-BP1表達(dá)增加了細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性[17]。進(jìn)一步研究顯示，4E-BP1與翻譯起始因子eIF4E的結(jié)合是4E-BP1介導(dǎo)腫瘤藥物敏感性的重要機(jī)制。4E-BP1低磷酸化時(shí)與eIF4E緊密結(jié)合，4E-BP1磷酸化增高可使其與eIF4E解離，從而促進(jìn)蛋白的翻譯。在肺癌細(xì)胞中，敲低eIF4E可減少帽依賴性復(fù)合物形成，從而增加癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CLPTM1L后顯著增加了4E-BP1的磷酸化，表明CLPTM1L抑制肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性很可能是通過增加4E-BP1的磷酸化，降低其與eIF4E結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CLPTM1L可抑制95-D肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。CLPTM1L過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)吉西他濱對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖的抑制、抑制吉西他濱誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是促進(jìn)了4E-BP1的磷酸化水平。