阮 鵬 譚愛麗

鼻咽癌是我國(guó)發(fā)病率較高的頭頸部惡性腫瘤之一，在我國(guó)南方部分地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率高達(dá)20/10萬(wàn)[1]。鼻咽癌起源于鼻咽的黏膜上皮，因腫瘤原發(fā)灶的特殊解剖結(jié)構(gòu)，病理上多表現(xiàn)為低分化腫瘤，具有極強(qiáng)的侵襲性，大多數(shù)鼻咽癌患者確診時(shí)多處于腫瘤晚期階段[2]。近年來(lái)隨著影像學(xué)診斷的進(jìn)步、放療和化療方案的更新，鼻咽癌的治愈率得到提高，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生仍是治療失敗的主要原因[3]。此外，即使是同一TNM分期的患者，在化療療效和預(yù)后上仍存在較大的差異[4]。因此如何有效預(yù)測(cè)鼻咽癌患者的化療效果和生存預(yù)后，對(duì)制定鼻咽癌患者的個(gè)性化治療方案具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度僅為18～22個(gè)核苷酸的小非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移侵襲等過程[5]。同時(shí)腫瘤細(xì)胞可釋放miRNA入外周血，而外周血中的miRNA穩(wěn)定性較強(qiáng)，作為新興生物學(xué)標(biāo)志物方面具有重要的臨床價(jià)值。有研究發(fā)現(xiàn)miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a在鼻咽癌中顯著上調(diào)，但它們?cè)谘逯械谋磉_(dá)量及對(duì)患者化療抗性的預(yù)測(cè)價(jià)值尚不清楚[6-7]。因此本研究主要評(píng)估血清中miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a對(duì)預(yù)測(cè)鼻咽癌患者化療療效和遠(yuǎn)期生存預(yù)后的臨床價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，并經(jīng)患者及其家屬簽署知情同意書。連續(xù)性納入2010年1月—2016年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診并接受治療的鼻咽癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于18周歲；(2)經(jīng)組織病理學(xué)診斷確診為鼻咽癌；(3)接受以順鉑為基礎(chǔ)的一線化療方案；(4)行為狀態(tài)評(píng)分(Karnofsky performance status，KPS)在60分以上；(5)肝腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并感染性或其他炎癥性疾??；(3)隨訪資料不詳。共納入187例鼻咽癌患者，其中男134例，女53例，年齡23～76歲(平均45.7±12.6歲)。同時(shí)納入60例健康體檢人群作為對(duì)照。

1.2 臨床資料收集

通過病史系統(tǒng)收集患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料和臨床病理學(xué)特征，包括性別、年齡、KPS評(píng)分、腫瘤病理診斷、化療方案等。還包括各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查和血清EV病毒抗體水平，包括EA/IgA和VCA/IgA。

1.3 化療方案

入組的患者均接受以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案。187例患者中，97例接受PF方案：順鉑(25 mg/m2，iv，d1-3)和5-氟尿嘧啶(500 mg/m2，iv，d1-5)，每3周進(jìn)行一次；56例接受TP方案：順鉑(25 mg/m2，iv，d1-3)和紫杉醇(175 mg/m2，iv，d1)，每3周進(jìn)行一次；余34例接受其他治療方案。化療周期的中位數(shù)為4(范圍2～12)。

1.4 血清miRNA檢測(cè)

1.4.1 血液樣本中循環(huán)miRNA提取 鼻咽癌患者入院后在初次化療前空腹采血，對(duì)照組人群于體檢當(dāng)天清晨空腹采血，置于EDTA抗凝管中，靜置30 min后，2000 r/min離心5 min，分離上層血清，置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存。通過miRNeasy mini kit外周血RNA提取試劑盒提取500 μL血清中的miRNA，并最終以20 μL的DEPC水洗脫，Nanodrop 2000測(cè)定RNA吸光度A260/A280介于1.8～2.0之間者可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 調(diào)整RNA濃度值500 ng/μL用于逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系：2×miScript II RT Mix 10 μL+2 μL RNA+8 μL DEPC水，共20 μL；反應(yīng)條件：45℃ 30 min，85℃10 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)6種miRNA，包括miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a，使用U6 snRNA作為內(nèi)參。引物序列見表1。所有反應(yīng)都設(shè)3復(fù)孔和空白對(duì)照，反應(yīng)體系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL+前/后引物混合物(5 μmol/L)1 μL+cDNA 1 μL+DEPC水 8 μL，共20 μL，反應(yīng)條件：94℃ 2 min，40個(gè)PCR循環(huán)(94℃ 15 s，62℃ 30 s)。擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為Ct值，△Ct則為每個(gè)樣品的待測(cè)miRNA的Ct值與內(nèi)參U6 snRNA的Ct值的差值，并以2-△△Ct作為循環(huán)miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 化療效果評(píng)估

化療結(jié)束后，根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.0)評(píng)估治療反應(yīng)[8]，包括完全緩解(Complete response，CR)、部分緩解(Partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(Stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(Progressive disease，PD)，其中CR和PR定義為化療敏感組(123例)，SD和PD定義為化療抵抗組(64例)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌化療敏感與抵抗患者的臨床資料比較

與化療敏感組相比，化療抵抗組T3-4期比例、N3期比例、TNM Ⅲ～Ⅳ期比例更高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但年齡、性別、EA/IgA滴度、VCA/IgA滴度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表1 熒光定量PCR引物序列

表2 敏感與抵抗患者的臨床資料比較[n(%)]

2.2 血清miRNA水平比較

鼻咽癌患者血清miR-127水平顯著高于健康對(duì)照組(4.3±1.6vs. 1.4±0.5，P<0.001)，但其它血清miRNA在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。亞組分析發(fā)現(xiàn)，化療抵抗組患者的血清miR-127水平顯著高于化療敏感組患者(4.5±1.3vs. 3.8±1.7，P<0.001)。

2.3 血清miR-127對(duì)化療抵抗的預(yù)測(cè)價(jià)值和閾值

通過ROC曲線分析顯示，血清miR-127對(duì)鼻咽癌患者化療抵抗價(jià)值較高(AUC=0.702，P<0.001)，血清miR-127對(duì)化療抵抗的預(yù)測(cè)閾值為4.2，靈敏度82.3%，特異度76.3%(圖2)。

圖1 鼻咽癌患者與健康人群的血清miRNA比較

2.4 血清miR-127與化療反應(yīng)性的關(guān)系

化療抵抗組血清miR-127≥4.2比例顯著高于化療敏感組(78.1%vs. 30.1%，P<0.001)(表3)。

2.5 鼻咽癌患者化療抵抗的影響因素分析

將表1中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的參數(shù)以及血清miR-127水平納入多因素Logistics回歸分析中，結(jié)果顯示，TNM分期(OR=1.655，95%CI：1.142～2.584，P=0.016)和血清miR-127≥4.2(OR=2.231，95%CI：1.762～4.503，P=0.001)是影響鼻咽癌患者化療抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

圖2 血清miR-127水平預(yù)測(cè)化療抵抗的ROC曲線分析

表3 血清miR-127與化療反應(yīng)性相關(guān)性[n(%)]

表4 影響鼻咽癌患者化療抵抗的多因素分析

3 討論

鼻咽癌化療抵抗是多種遺傳因素導(dǎo)致的復(fù)雜且多步驟過程，如抗凋亡基因的上調(diào)、抑癌基因的下調(diào)和藥物代謝基因的改變等[9]。因此研究影響鼻咽癌化療抵抗的分子機(jī)制和尋找化療敏感性標(biāo)志物是目前臨床上備受關(guān)注的問題。目前主要通過血液標(biāo)志物、免疫組織化學(xué)檢查等評(píng)估鼻咽癌患者的生存預(yù)后，但針對(duì)化療抗性的標(biāo)志物研究較少。

miRNA是一類高度非編碼的小RNA分子，可結(jié)合到目標(biāo)mRNA的3′非編碼區(qū)以調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA的降解，從而抑制蛋白的表達(dá)。近年來(lái)的研究表明miRNA可作為促癌基因或抑癌基因而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥能力具有調(diào)控作用[10]。而在鼻咽癌中，miRNA也參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥，并可作為標(biāo)志物對(duì)鼻咽癌進(jìn)行分子分型[11]。但如何通過miRNA的檢測(cè)來(lái)判斷鼻咽癌患者的化療抗性是目前研究的熱點(diǎn)。

miR-127位于第14號(hào)常染色體q32.2區(qū)域內(nèi)，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括鼻咽癌、胃癌、肺癌等[12-13]。miR-127能夠激活NFκB-TNFα信號(hào)通路而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和化療耐藥。此外，miR-127還能夠直接抑制抑癌基因SEPT7和BCL6的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[14-15]。腫瘤細(xì)胞可分泌miRNA至外周血中，血清中的miRNA水平可作為一種理想的腫瘤標(biāo)志物[16]。Lu等[17]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清內(nèi)miR-127水平顯著上調(diào)，并且上調(diào)的miR-127能夠提高對(duì)乳腺癌的診斷準(zhǔn)確性；You等[18]則發(fā)現(xiàn)血清miR-127的上調(diào)能夠有效鑒別宮頸癌，并且與宮頸癌患者的遠(yuǎn)期生存預(yù)后不良密切相關(guān)。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)了鼻咽癌患者血清中miR-127水平顯著高于正常人群，并且升高的miR-127與鼻咽癌患者的化療抵抗密切相關(guān)。通過ROC曲線分析證實(shí)血清中miR-127≥4.2是預(yù)測(cè)鼻咽癌患者化療抵抗的最佳閾值，進(jìn)一步通過多因素回歸分析確定血清miR-127水平升高是預(yù)測(cè)鼻咽癌化療抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示了血清miR-127水平可作為有效預(yù)測(cè)鼻咽癌患者化療抗性的有效標(biāo)志物。

綜上所述，本研究證實(shí)鼻咽癌患者的血清miR-127水平顯著上調(diào)，與鼻咽癌患者化療抵抗密切相關(guān)，是預(yù)測(cè)鼻咽癌患者化療抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但由于本研究?jī)H為單中心、小樣本回顧性研究，因此仍需要擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)一步證實(shí)本研究，并將血清miR-127檢測(cè)應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。