豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分離培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)分化研究

孟金花，蔡剛志，肖紅衛(wèi)，華再東，畢延震，鄭新民，任紅艷

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）是影響豬肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵因素，研究豬肌內(nèi)脂肪合成、代謝及調(diào)控規(guī)律對(duì)于優(yōu)化畜禽體脂比例、改良肉質(zhì)品質(zhì)具有重要意義，而深入其代謝規(guī)律最為便利快捷的方式是借助于體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞。脂肪前體細(xì)胞最早在1964 年從大鼠的脂肪組織中分離獲得。隨后科研人員相繼建立了3T3-L1、3T3-F442A、SVF 等脂肪前體細(xì)胞[1-3]。IMF是機(jī)體發(fā)育最晚的脂肪，具備特殊的增殖和分化方式[4]，因此體外研究培養(yǎng)的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞應(yīng)來(lái)源于肌肉內(nèi)而不是脂肪組織中的脂肪細(xì)胞，這樣才可以在研究中更為真實(shí)地反映肌內(nèi)脂肪的分化調(diào)控特點(diǎn)，而細(xì)胞系的培養(yǎng)通常不能代表在體情況[5-6]。因此有必要建立直接來(lái)自于動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)體系，這樣不僅可以直觀地反映肌內(nèi)脂肪的發(fā)生和增生的完整過(guò)程，而且還能較為精準(zhǔn)地研究各種因素對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)控機(jī)制。

脂肪前體細(xì)胞原代培養(yǎng)體系已成功地在人、鼠、牛、豬等動(dòng)物體中構(gòu)建[7-11]。本實(shí)驗(yàn)在總結(jié)前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化操作條件，使用膠原酶消化法成功建立了豬的肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法。在細(xì)胞分離操作過(guò)程中，對(duì)組織的活力、酶消化的時(shí)間和溫度、操作過(guò)程的用時(shí)、離心力大小及離心次數(shù)等方面進(jìn)行了優(yōu)化，建立了穩(wěn)定的原代豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分離方法，為豬脂肪沉積相關(guān)基因的功能研究提供了細(xì)胞素材。

1 材料與方法

1.1 材料 Ⅱ型膠原酶、胰島素（Ins）、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅O 染液等購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清、DPBS 和DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司。總甘油三酯測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊生物科技有限公司。

1.2 豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分離 大約克豬背最長(zhǎng)肌樣品采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)出生5 d的純種大約克豬。在實(shí)驗(yàn)室將仔豬進(jìn)行麻醉處死后將豬體浸泡在新潔爾滅溶液中清洗干凈后，取出用75% 酒精擦干。無(wú)菌條件下快速采取背最長(zhǎng)肌組織，放入添加了高濃度雙抗的DPBS 中漂洗3 次，隨后在超凈工作臺(tái)內(nèi)剔除掉表面的血管與結(jié)締組織，剪成0.5～1 mm3的小碎塊裝入50 mL 離心管中。加入10～15 mL Hank’s 緩沖液，添加46 U/μL 的Ⅱ型膠原酶至終濃度0.2 U/μL，37℃消化2 h。消化完成后，懸液通過(guò)74 μm 的細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至離心管中2 000 r/min 離心5 min，用DMEM/F12 漂洗沉淀1 次。加入預(yù)熱的紅細(xì)胞裂解液，吹吸混勻，37℃水浴10 min，再用37 μm 的濾網(wǎng)過(guò)濾，2 000 r/min 離心5 min，DMEM/F12 繼續(xù)漂洗1 次。所得細(xì)胞沉淀使用培養(yǎng)基完全吹散，滴加入裝有完全培養(yǎng)基的細(xì)胞瓶中，在37℃，5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由于貼壁速度的差異，肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞約在接種后2 h 即可以貼壁，而其他雜細(xì)胞的貼壁速度較慢，因此采用差速貼壁法進(jìn)行純化處理。接種培養(yǎng)2 h 后，吸掉瓶中原液，使用DMEM/F12 清洗2 次，加入新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 給予新的培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，吸棄原有培養(yǎng)基，使用DPBS 洗1～2 次，加入0.25% 胰酶室溫消化2 min 左右。在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞開(kāi)始收縮，彼此分開(kāi)，立即吸掉胰酶，加入完全培養(yǎng)液終止消化。槍頭輕輕吹打細(xì)胞，原代分離的細(xì)胞較為脆弱而且貼壁力不強(qiáng)，因此在分散過(guò)程中應(yīng)注意避免機(jī)械損傷。轉(zhuǎn)移懸液至1.5 mL 離心管，3 000 r/min 離心2 min，去上清，加入適量培養(yǎng)基分散細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)所需的接種密度滴加至新瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首次傳代后，可適當(dāng)增大培養(yǎng)基中FBS（Fetal Bovine Serum，胎牛血清）的含量（15%～20%），有利于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.4 細(xì)胞凍存 選擇生長(zhǎng)旺盛以及存活率高的細(xì)胞進(jìn)行凍存。細(xì)胞的收集方法同細(xì)胞傳代步驟，收集好后DPBS 洗1 遍，去除干凈上清。加入500 μL 凍存液收集離心管中細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)（提前在管外壁上寫(xiě)好種類(lèi)、代數(shù)、操作者、日期等），注意擰緊管蓋，防止后期液氮進(jìn)入管內(nèi)。將細(xì)胞按照4℃ 30 min，-80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至液氮的順序進(jìn)行緩慢凍存。

1.5 豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化 待培養(yǎng)板中細(xì)胞完全匯合時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)。分化培養(yǎng)基由5 μg/mL Ins（胰島素）、0.5 μmol/L IBMX（3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）和1 μmol/L DEX（地塞米松）組成[12]。細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，隨后換用含有5 μg/mL Ins 的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，之后每3 d 更換新的完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，直至90% 的細(xì)胞出現(xiàn)脂滴。每天觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)變化規(guī)律。

1.6 油紅O 染色鑒定 誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，用DPBS 輕輕洗3 遍，防止細(xì)胞被緩沖液沖掉。使用濾紙沿著培養(yǎng)板側(cè)壁吸干殘留在培養(yǎng)孔中的液體，24 孔板每孔加入500 μL 4% 多聚甲醛，室溫下放置40 min固定細(xì)胞。固定完成后，吸棄多聚甲醛溶液，DPBS 洗2 遍，每孔加入500 μL 0.5%的油紅O 工作液，室溫染色45 min。期間可在顯微鏡下進(jìn)行觀察，脂滴顏色逐漸變深。吸去染液，60% 異丙醇浸潤(rùn)10～20 s，DPBS清洗2 遍除去多余染液，使用倒置顯微鏡觀察染色情況并拍取照片。

1.7 細(xì)胞甘油三酯含量測(cè)定 取誘導(dǎo)分化0、3、6、9、12 d 的細(xì)胞，用DPBS 清洗3 次后，按照甘油三酯測(cè)定試劑盒（北京普利萊公司）操作說(shuō)明測(cè)定并根據(jù)對(duì)應(yīng)公式計(jì)算甘油三酯含量。每個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，檢測(cè)540 nm 處的OD 值。

甘油三酯和蛋白濃度均在540 nm 處測(cè)定OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，以每mg 蛋白濃度對(duì)甘油三酯含量進(jìn)行校正。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 20.0 對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)顯示為3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 如圖1 所示，使用差速貼壁法獲得了相對(duì)純凈的肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞，分離的細(xì)胞接種2 h 后部分貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)較為均一，清洗換液以去除未貼壁雜細(xì)胞；原代培養(yǎng)24 h 后可以觀察到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞形態(tài)大部分變?yōu)槎趟笮?、多邊形或不?guī)則的小三角形；持續(xù)培養(yǎng)至72 h，細(xì)胞快速增殖加速生長(zhǎng)，體積變大，數(shù)量增多，匯合度達(dá)90% 以上，聚集成放射狀單層細(xì)胞，形態(tài)類(lèi)似于成纖維細(xì)胞樣。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)生密度抑制后停止生長(zhǎng)，渦旋狀單層緊密排布，不會(huì)出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)的狀況。

圖1 原代肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞培養(yǎng)2、24、72 h 的形態(tài)（×100）

2.2 豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞傳代培養(yǎng) 使用胰酶消化傳代后的細(xì)胞2 h 左右即會(huì)貼壁，形態(tài)與原代細(xì)胞基本相同，但細(xì)胞的增殖速度明顯比原代細(xì)胞快。傳代次數(shù)較少時(shí)不會(huì)觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，但隨著細(xì)胞的代數(shù)增加（9～10 代），肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞較容易出現(xiàn)自發(fā)充脂現(xiàn)象，小部分細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)微小脂滴，持續(xù)培養(yǎng)可觀察到脂滴逐漸聚集。

2.3 豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及油紅O 鑒定 傳代培養(yǎng)的細(xì)胞不經(jīng)誘導(dǎo)只會(huì)進(jìn)行增殖很少發(fā)生分化。在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基環(huán)境中生長(zhǎng)2 d，顯微鏡下未能觀察到明顯的脂滴；生長(zhǎng)3 d 后細(xì)胞體積變大，形狀變?yōu)椴灰?guī)則的扁平形，還可看到一少部分細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)微小的明亮圓粒小脂滴，培養(yǎng)基顏色略微變黃；誘導(dǎo)第3 天開(kāi)始出現(xiàn)單個(gè)脂滴，第6 天后可以看到含有脂滴的細(xì)胞有所增多，而且脂滴的大小不均勻，數(shù)量變多；誘導(dǎo)12 d后發(fā)現(xiàn)充脂的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，形成“葡萄串”狀脂滴（圖2）。

油紅O 染色法可以靈敏準(zhǔn)確地檢測(cè)出體外培養(yǎng)的脂肪前體細(xì)胞的分化率，常被用于脂肪細(xì)胞的鑒定。本實(shí)驗(yàn)使用該方法對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行染色處理，在顯微鏡下檢測(cè)脂滴，觀察到細(xì)胞內(nèi)部大小各不同的圓粒脂滴經(jīng)染色后變?yōu)榧t色，由此可確定本實(shí)驗(yàn)成功分離出肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞，且細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后已分化為成熟的脂肪細(xì)胞（圖2）。

圖2 肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定（×100）

2.4 豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化過(guò)程中甘油三酯含量變化由圖3 可見(jiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量逐漸增加；培養(yǎng)9 d 的細(xì)胞，充脂速度顯著增加；繼續(xù)培養(yǎng)至12 d 的細(xì)胞可見(jiàn)甘油三酯含量增加不明顯，說(shuō)明細(xì)胞已接近于完全分化，與形態(tài)所觀察到的結(jié)果相吻合。

3 討 論

影響分離原代脂肪前體細(xì)胞的因素有很多，不同研究對(duì)取材對(duì)象、消化時(shí)間、離心力和培養(yǎng)基的選擇各有不同。離心過(guò)程是影響細(xì)胞分離效果的一個(gè)重要因素，分離過(guò)程中應(yīng)減少不必要的離心次數(shù)，以降低細(xì)胞丟失量；同時(shí)離心力應(yīng)控制在合理范圍，轉(zhuǎn)數(shù)太小時(shí)細(xì)胞不能充分沉淀，轉(zhuǎn)數(shù)太大則會(huì)損傷細(xì)胞影響接種后的活力。不同物種的脂肪前體細(xì)胞離心力和離心時(shí)間不盡相同，牛的脂肪前體細(xì)胞分離時(shí)用186 ×g 離心10 min[13]；分離山羊的脂肪前體細(xì)胞時(shí)離心條件為2 000 r/min 離心5 min[14]；人的脂肪前體細(xì)胞分離時(shí)需要在1 000 r/min 離心5 min[15]。鄭月英等[16]分離梅山豬脂肪前體細(xì)胞時(shí)用到的離心條件是1 200 r/min 離心10 min。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的分離以2 000 r/min 的轉(zhuǎn)數(shù)離心分離為最佳，所得細(xì)胞數(shù)量適宜，活力較強(qiáng)。分離操作過(guò)程用時(shí)過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)胞的活性，還有可能造成污染，因此在整個(gè)操作過(guò)程中應(yīng)盡量縮短用時(shí)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)幾次分離培養(yǎng)操作對(duì)比發(fā)現(xiàn)，取材對(duì)象也是細(xì)胞成功分離培養(yǎng)的重要條件。本研究發(fā)現(xiàn)，豬脂肪前體細(xì)胞理想的取材對(duì)象是3～7 d 生理狀況良好、健康的新生仔豬，以確保細(xì)胞來(lái)源的活力。日齡越小越好，大于10 d 的仔豬已不適用于分離豬脂肪前體細(xì)胞。采集的背最長(zhǎng)肌組織用0.2% Ⅱ型膠原酶在37℃水浴搖床條件下消化2 h，期間取出消化混合液輕輕渦旋幾次，有利于組織的分散，提升細(xì)胞獲得率。雖然消化時(shí)長(zhǎng)與細(xì)胞得率呈正比，但膠原酶會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，因此應(yīng)控制在適當(dāng)?shù)臅r(shí)長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行消化。

本實(shí)驗(yàn)分離獲得的肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)72 h 后，細(xì)胞匯合度達(dá)即可達(dá)90%以上，由分散的短梭形或小三角形轉(zhuǎn)變?yōu)閱螌虞^為緊密生長(zhǎng)的類(lèi)似成纖維細(xì)胞的形態(tài)。消化傳代培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，增殖能力強(qiáng)。相關(guān)研究報(bào)道，肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞是不容易發(fā)生自發(fā)分化的[17-18]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種能夠誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞分化的試劑，其中添加Ins、DEX和IBMX 的激素混合物組合是誘導(dǎo)細(xì)胞分化的最有效的方法[19-20]。因此通過(guò)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及前期試驗(yàn)摸索，建立以下誘導(dǎo)體系，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞板后，使用含5 μg/mL Ins、0.5 μmol/L IBMX 與1 μmol/L DEX 的 成脂分化培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，換用含5 μg/mL Ins 的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，隨后每隔3 d 給予新的完全培養(yǎng)基。觀察到細(xì)胞在誘導(dǎo)3 d 即出現(xiàn)少量小脂滴，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴數(shù)量增多體積增大，在9～12 d 形成較多大脂滴，細(xì)胞的形態(tài)近似于成熟脂肪細(xì)胞。通過(guò)油紅O 染色法對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，證實(shí)所分離細(xì)胞即為肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞。此外，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量隨誘導(dǎo)時(shí)間呈時(shí)序性增加，該結(jié)果與以上觀察到的細(xì)胞形態(tài)變化情況相吻合。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)經(jīng)典的膠原酶消化法并結(jié)合差速貼壁法進(jìn)行純化，成功建立了豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)體系。所分離的細(xì)胞純度較高，增殖和分化能力旺盛。誘導(dǎo)分化鑒定實(shí)驗(yàn)證實(shí)所分離的細(xì)胞為具有典型特征的肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞，細(xì)胞傳代后依然表現(xiàn)出較高的生長(zhǎng)活性，這為后續(xù)體外研究豬肌內(nèi)脂肪代謝以及沉積機(jī)理奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。