雙向發(fā)酵提取燕麥β-葡聚糖及其理化性質研究

吳迪，邴雪，王昌濤，2，*，李萌，趙丹，張佳嬋

（1.北京工商大學理學院，植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室，北京100048；2.北京工商大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048）

燕麥起源于我國，目前，燕麥是全球禾谷類農作物的八大糧食之一，主要種植于北半球的溫帶地區(qū)[1]。燕麥中含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質、β-葡聚糖，有益于身體健康[2]。燕麥β-葡聚糖的分子結構已經被廣泛研究[3-7]，其是β-D-吡喃葡萄糖通過 30%的 β-（1→3）糖苷鍵和 70%的 β-（1→4）糖苷鍵連接而成的一種高分子、無分支、線性和黏性多糖。研究表明，燕麥β-葡聚糖具有較強的吸附小分子物質的能力，與蛋白質進行競爭，可與多酚通過氫鍵、疏水相互作用等結合，形成多糖多酚復合物，為機體提供更為持久的抗氧化能力[8]。在食品方面，燕麥β-葡聚糖不僅具有顯著的降血脂作用和減肥功效，還可以作為益生元調節(jié)機體腸道菌群結構[9]。

所謂“雙向發(fā)酵”是指采用具有一定活性成分的中藥材或藥渣作為藥性基質來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的營養(yǎng)基質，并把經過優(yōu)選的菌種加入其中進行微生物轉化，它們構成的發(fā)酵組合稱作藥用菌質[10]。試驗表明，雙向發(fā)酵具有增效擴用及解毒持效的作用[11]。

藥食用真菌是指對疾病有治療、預防及抑制作用或具有保健功效的一類真菌，在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中占有重要的位置[12]。藥食用真菌的抗氧化活性研究一直是人們探究機體氧化抗氧化平衡的研究熱點，不少研究都表明其含有比較好的抗氧化功能[13]。近年來，藥食用真菌及其活性成分因其獨特的生物活性及安全無毒副作用而被廣泛應用。很多醫(yī)藥公司、企業(yè)、科研院所等一直致力于藥食用菌的研究工作，研制出了一系列藥品和保健品等，并已投入生產[14]。

故本試驗選用藥食用真菌與燕麥麩皮進行雙向發(fā)酵，獲得更高產量的燕麥β-葡聚糖的同時利用燕麥麩皮，并對燕麥β-葡聚糖的提取工藝進行優(yōu)化，對其理化性質進行進一步的研究，為其在食品中的應用提供可行性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥麩皮：張家口面粉廠；靈芝、桑黃、猴頭、紅曲霉、裂褶菌、大球蓋菇、雞樅菌、海鮮菇、黃傘、大杯傘、白玉木耳、灰樹花：中國普通微生物保藏管理中心；α-淀粉酶：上海麥克林生化科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基、β-葡萄糖：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；剛果紅：上海源葉生物有限公司；NaNO3、Na2CO3、酒石酸鉀鈉、硫酸銅（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；福林酚、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、乙醇（均為分析純）：北京北化精細化學品有限責任公司。

1.2 儀器與設備

T6紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；（e2695）高效凝膠色譜、2414示差檢測器：美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

1.3.1.1 菌種的活化

活化培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖水液體培養(yǎng)基，70 mL培養(yǎng)基裝于250 mL容量瓶中，28℃，180 r/min。斜面中挑取菌落接種于液體培養(yǎng)基中，置于搖床，在適宜的條件下進行菌種的活化。

1.3.1.2 菌種的純化

活化的菌種按梯度稀釋進行鋪板，以便獲取單一菌落。

1.3.1.3 菌種的擴培

將純化后的菌種接種到馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基，在適宜溫度的搖床中培養(yǎng)，當OD值=0.6時，即菌種處于對數(shù)生長期時，此時為合適的接種濃度。

1.3.1.4 菌種的接種和發(fā)酵

燕麥麩皮與水按照1∶25（g/mL）的比例配制，作為待擴培培養(yǎng)基，吸取已擴培的菌液2 mL接種到200 mL培養(yǎng)基中，pH=5，28℃，180 r/min在搖床中發(fā)酵。

1.3.1.5 檢測β-葡聚糖

每隔24小時，取發(fā)酵液，高溫高壓滅菌失活后12 000/min離心20 min，取上清液，用剛果紅法進行β-葡聚糖含量的測定。

1.3.2 工藝優(yōu)化

對篩選出的黃傘、大杯傘、灰樹花3種真菌分別與燕麥麩皮進行雙向發(fā)酵，隨后進行工藝優(yōu)化的探究，進行單因素試驗及正交試驗。以β-葡聚糖含量作為指標，以發(fā)酵時間、pH值、發(fā)酵溫度和燕麥麩皮與水混合的料液比作為影響因素進行單因素試驗和正交試驗。

1.3.3 燕麥β-葡聚糖的純化

將未經發(fā)酵的燕麥麩皮與水的混合液、黃傘與燕麥麩皮雙向發(fā)酵的發(fā)酵液、灰樹花與燕麥麩皮雙向發(fā)酵的發(fā)酵液、大杯傘與燕麥麩皮雙向發(fā)酵的發(fā)酵液通過去蛋白、去淀粉和醇沉，得到較純的燕麥β-葡聚糖。

純化的步驟：

1）將未經發(fā)酵的燕麥麩皮水提液及加入3種真菌的發(fā)酵液，在12 000 r/min的條件下進行離心，10分鐘后，取上清液。

2）在取出的上清液中加入適量的耐高溫α-淀粉酶，12 000 r/min條件下進行離心，10分鐘后，取上清液進行后續(xù)試驗。

3）在上清液中加入乙醇，含量達60%，放入4℃冰箱靜置保存過夜，取出后離心，取沉淀。

4）重復步驟（3），將沉淀收集起來進行后續(xù)的試驗。

5）在得到的沉淀中加入適量的去離子水進行復溶，冷凍干燥后即可得到較純的燕麥β-葡聚糖。

1.3.4 高效凝膠色譜法測定β-葡聚糖分子量

高效凝膠色譜法：流動相：0.15 mol/L NaNO3；凝膠柱：水溶性SB-803HQ、水溶性線性SB-806HQ；保護柱：SB-G；檢測器：激光多角度檢測器Wyatt DAWN HELEOS-II、示差檢測器Wyatt Optilab VEX；泵：LC-20AD；恒溫箱：CTO-20A。

用流動相配制濃度1 mg/mL β-葡聚糖溶液，在室溫下溶解30 min后進樣，通過軟件ASTRA5.3.4.13得到樣品分子量。

1.3.5 β-葡聚糖及發(fā)酵液蛋白含量測定

將4種純化的β-葡聚糖用去離子水配制成1 g/L的溶液，并與純化之前的4種溶液一同進行蛋白含量測定，采用福林酚法。

稱取 10 g Na2CO3、2 g NaOH、0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水中為A，0.5 g硫酸銅溶于100 mL去離子水為B，A與B按50∶1的體積比配制為試劑甲。取福林酚（sigma company）與去離子水1∶1的體積比配制成試劑乙。不同濃度的標準蛋白質溶液進行測試繪制標準曲線。在1 mL樣品溶液中加入5 mL試劑甲迅速混合放入25℃水浴10 min。逐管加入0.5 mL試劑乙，立即混合，25℃水浴反應30分鐘后在700 nm處測吸光度。

1.3.6 β-葡聚糖及發(fā)酵液總糖含量測定

將4種純化的β-葡聚糖用去離子水配制成1 g/L的溶液，并與純化之前的4種溶液一同進行總糖含量測定，采用苯酚硫酸法。

準確稱取無水葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，用去離子水進行定容，得到濃度1 g/L葡萄糖溶液作為標準溶液。取10 g苯酚，加去離子水190 mL得到濃度為5%苯酚溶液，職于棕色瓶中避光。

標準曲線繪制：精確稱取濃度為1 g/L葡萄糖溶液1、2、3、4、5 mL，加入 50 mL 容量瓶進行定容，準確吸取2 mL該系列溶液，以去離子水做空白對照，分別置于試管中，進行比色反應，繪制標準曲線。

樣品測定：取樣品溶液2 mL放入試管中，以2 mL去離子水做為空白對照，加1 mL濃度為5%的苯酚溶液進行混勻；加入5 mL的濃硫酸，混勻，5 min后，封管在沸水浴中反應1 h；取出后冷卻至室溫，在490 nm波長處測吸光度值。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

剛果紅法測β-葡聚糖含量的標準曲線為y=0.003 8x+0.006 5，R2=0.998 48。12種真菌進行雙向發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液的β-葡聚糖含量隨時間的變化見圖1。

圖1 12種真菌雙向發(fā)酵后β-葡聚糖含量Fig.1 Content of β-glucan after bidirectional fermentation of 12 fungi

其中黃傘、大杯傘、灰樹花3種真菌在生長過程中β-葡聚糖就釋放出來，黃傘、大杯傘在48 h達到穩(wěn)定狀態(tài)，β-葡聚糖的含量分別穩(wěn)定在 287、220 μg/mL 左右，β-葡聚糖總含量為未進行雙向發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液中的含量的近三倍和兩倍?；覙浠偤吭?2 h達到穩(wěn)定狀態(tài)，β-葡聚糖的含量穩(wěn)定在184 μg/mL左右，β-葡聚糖總含量為未進行雙向發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液中的β-葡聚糖含量的近三倍。大球蓋菇經發(fā)酵后β-葡聚糖總含量比未發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液中的β-葡聚糖含量高，但其數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。其余8種真菌在雙向發(fā)酵過程中β-葡聚糖被利用分解，最終含量比未發(fā)酵燕麥麩皮水溶液中的β-葡聚糖含量低。故篩選出黃傘、大杯傘、灰樹花3種真菌進行雙向發(fā)酵以達到增加β-葡聚糖含量的目的，作為后續(xù)β-葡聚糖純化以及功效評價試驗的試驗對象。

2.2 工藝優(yōu)化

2.2.1 黃傘燕麥雙向發(fā)酵提取β-葡聚糖工藝優(yōu)化

2.2.1.1 單因素試驗結果

試驗結果見表1。

表1 不同發(fā)酵條件對黃傘與燕麥麩皮水溶液發(fā)酵中β-葡聚糖含量的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions on the content of β-glucan in Pholiota adiposa-oat bran aqueous solution

保持 pH=5、發(fā)酵溫度為 28℃、料液比為1∶25（g/mL），時間選取24、48、72 h，由試驗結果表明，最佳發(fā)酵時間為48 h。

保持發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，料液比為 1 ∶25（g/mL），選取 pH 值為 4、5、6，由試驗結果表明，最佳發(fā)酵pH值為5。

保持發(fā)酵時間為 48h，pH=5，料液比為 1∶25（g/mL），發(fā)酵溫度選取25、28、37℃，由試驗結果表明，最佳發(fā)酵溫度為28℃。

保持發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，pH值為5，料液比選取為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），雖然結果為料液比為1∶15（g/mL）時β-葡聚糖含量最高，但考慮原料的利用率選為最佳發(fā)酵料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.1.2 正交試驗結果

單因素試驗表明，料液比選取 1∶20（g/mL）、時間48 h、pH=5、溫度28℃為黃傘與燕麥麩皮的最佳發(fā)酵條件。設計如下正交試驗，正交試驗因素水平表見表2，試驗結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表-黃傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 2 Table of orthogonal test factor-fermentation of Pholiota adiposa and oat bran

由表3可知，4個因素對β-葡聚糖得率均有影響，影響大小為D＞B＞C＞A，即發(fā)酵時間、料液比（g/mL）、pH值和發(fā)酵溫度；確定最佳提取工藝組合為A2B1C2D2，即發(fā)酵溫度 28 ℃、料液比 1 ∶20（g/mL）、pH=5、發(fā)酵時間48 h。用正交最佳組合進行驗證，得到β-葡聚糖得率在289 μg/mL左右，與正交試驗結果相似，故選取此組合為最佳組合。

表3 正交試驗方案與結果-黃傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 3 Protocol and results of orthogonal test-fermentaion of Pholiota adiposa and oat bran

2.2.2 大杯傘燕麥雙向發(fā)酵提取β-葡聚糖工藝優(yōu)化

2.2.2.1 單因素試驗結果

不同發(fā)酵條件對大杯傘與燕麥麩皮水溶液發(fā)酵中β-葡聚糖含量的影響試驗結果見表4。

保持 pH=5、發(fā)酵溫度為 28℃、料液比為 1∶25（g/mL），時間選取24、48、72 h，由試驗結果表明，最佳發(fā)酵時間為48 h。

表4 不同發(fā)酵條件對大杯傘與燕麥麩皮水溶液發(fā)酵中β-葡聚糖含量的影響Table 4 Effects of different fermentation conditions on the content of β-glucan in Clitocybe maxima-oat bran aqueous solution

保持發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，料液比為 1 ∶25（g/mL），選取 pH 值為 4、5、6，由試驗結果表明，最佳發(fā)酵pH值為5。

保持發(fā)酵時間為 48h，pH=5，料液比為 1∶25（g/mL），發(fā)酵溫度選取25、28、37℃，由試驗結果表明，最佳發(fā)酵溫度為28℃。

保持發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，pH值為5，料液比選取為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），雖然結果為料液比為1∶15（g/mL）時β-葡聚糖含量最高，但考慮原料的利用率選為最佳發(fā)酵料液比為1∶25（g/mL）。

2.2.2.2 正交試驗結果

單因素試驗表明，料液比選取 1∶25（g/mL）、時間48 h、pH=5、溫度28℃為大杯傘與燕麥麩皮的最佳發(fā)酵條件。后設計如下正交試驗，正交試驗因素水平表見表5，結果見表6。

表5 正交試驗因素水平表-大杯傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 5 Table of orthogonal test factor-fermentaion of Clitocybe maxima and oat bran

由表6可知，4個因素對β-葡聚糖得率均有影響，影響大小為B＞C＞A＞D，即分別為料液比、pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間；確定最佳提取工藝組合為A2B2C2D2，即發(fā)酵溫度 28 ℃、料液比 1 ∶25（g/mL）、pH=5、發(fā)酵時間48 h。用正交最佳組合進行試驗，得到β-葡聚糖得率在237 μg/mL左右，低于正交試驗組合A1B2C2D2，故選正交試驗組合A1B2C2D2為最佳組合。

表6 正交試驗方案與結果-大杯傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 6 Protocol and results of orthogonal test-fermentaion of Clitocybe maxima and oat bran

2.2.3 灰樹花燕麥雙向發(fā)酵提取β-葡聚糖工藝優(yōu)化

2.2.3.1 單因素試驗結果

不同發(fā)酵條件對灰樹花與燕麥麩皮發(fā)酵液β-葡聚糖含量的影響試驗結果見表7。

表7 不同發(fā)酵條件對灰樹花與燕麥麩皮發(fā)酵液β-葡聚糖含量的影響Table 7 Effects of different fermentation conditions on the content of β-Glucan in Ramalina-oat bran aqueous solution

保持 pH=5、發(fā)酵溫度為 28℃、料液比為 1∶25（g/mL），時間選取24、48、72 h，試驗結果表明，最佳發(fā)酵時間為72 h。

保持發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，料液比為 1 ∶25（g/mL），選取 pH 值為 4、5、6，試驗結果表明，最佳發(fā)酵pH值為5。

保持發(fā)酵時間為 48h，pH=5，料液比為 1∶25（g/mL），發(fā)酵溫度選取25、28、37℃，試驗結果表明，最佳發(fā)酵溫度為25℃。

保持發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，pH值為5，料液比選取為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），雖然料液比為1∶15（g/mL）時β-葡聚糖含量最高，但考慮原料的利用率選為最佳發(fā)酵料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.3.2 正交試驗結果

通過單因素試驗表明料液比選取1：20（g/mL）、時間48 h、pH=5、溫度28℃為灰樹花與燕麥麩皮的最佳發(fā)酵條件。后設計如下正交試驗，正交試驗因素水平表見表8，結果見表9。

表8 正交試驗因素水平表-灰樹花、燕麥麩皮發(fā)酵Table 8 Table of orthogonal test factor-fermentaion of Ramalina and oat bran

表9 正交試驗方案與結果-灰樹花、燕麥麩皮發(fā)酵Table 9 Protocol and results of orthogonal test-fermentaion of Ramalina and oat bran

由表9可知，4個因素對β-葡聚糖得率均有影響，影響大小為C＞B＞D＞A，即分別為pH值、料液比、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度；確定最佳提取工藝組合為A2B1C2D2，即提取溫度 25℃、料液比 1 ∶20（g/mL）、pH=5、提取時間72 h。用正交最佳組合進行試驗，得到β-葡聚糖得率在192.58 μg/mL左右，與正交試驗結果類似，故選擇此組合為最佳組合。

2.3 燕麥β-葡聚糖的純化

2.3.1 淀粉的去除

提取過程中，由于溫度的升高，淀粉在提取液中糊化，與β-葡聚糖一起被提取出來，故要去除淀粉。本試驗用α-淀粉酶在80℃下反應，以達到除去淀粉的目的，試驗結果見表10。

表10 α-淀粉酶水解4種燕麥麩皮發(fā)酵液的效果Table 10 Effect of α-amylase hydrolyzed starch of four oat bran fermentation broth

考慮到資源和淀粉清除率，在去除純燕麥麩皮提取液時α-淀粉酶加量為1%，反應時間30 min。黃傘燕麥麩皮發(fā)酵液α-淀粉酶加酶量為0.8%，反應時間30 min。大杯傘燕麥麩皮發(fā)酵液α-淀粉酶加酶量為1%，反應時間30 min?；覙浠ㄑ帑滬熎ぐl(fā)酵液α-淀粉酶加酶量為1%，反應時間30 min。

2.3.2 蛋白的去除

sevage法去蛋白，硫酸銅法測蛋白含量。3個條件進行單因素試驗，分別為sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比 6 ∶1、5 ∶1、4 ∶1、3 ∶1、2 ∶1，sevage試劑的添加量為總體積的 1/6、1/5、1/4、1/3、1/2 及沖洗次數(shù) 1、2、3、4。以去蛋白前后的吸光度差值作為參考。

1）sevage試劑中氯仿與正丁醇的比例的影響

控制sevage試劑的添加量為1/2，沖洗次數(shù)為2，sevage試劑中氯仿與正丁醇的比例的影響見圖2。

圖2 氯仿與正丁醇比例對不同發(fā)酵液蛋白清除率的影響Fig.2 Effect of the ratio of trichloromethane to n-butanol on the protein clearance rate of different fermentation broth

如圖所示，sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為4∶1時，蛋白質的清除率達到穩(wěn)定，未經發(fā)酵的燕麥麩皮水提液蛋白質清除率在16.5%左右，黃傘燕麥發(fā)酵液的蛋白質清除率在18.75%左右，大杯傘燕麥發(fā)酵液蛋白質清除率在21%左右，灰樹花燕麥發(fā)酵液的蛋白質清除率在19.3%左右。

2）sevage試劑的添加量的影響

控制sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為4∶1，沖洗次數(shù)為2，sevage試劑的添加量的影響見圖3。

圖3 sevage試劑添加比例對不同發(fā)酵液蛋白清除率的影響Fig.3 Effect of the addition ratio of sevag reagent on the protein clearance rate of different fermentation broth

如圖所示，sevage試劑的添加量為總體積的1/2時，蛋白質的清除率達到穩(wěn)定，未經發(fā)酵的燕麥麩皮水提液蛋白質清除率在16.65%左右，黃傘燕麥發(fā)酵液的蛋白質清除率在18.8%左右，大杯傘燕麥發(fā)酵液蛋白質清除率在21%左右，灰樹花燕麥發(fā)酵液的蛋白質清除率在18.8%左右。

3）沖洗次數(shù)的影響

控制sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為4∶1，sevage試劑的添加量為1/2，沖洗次數(shù)的影響如圖4。

如圖所示，沖洗次數(shù)為2次時，蛋白質的清除率達到穩(wěn)定，未經發(fā)酵的燕麥麩皮水提液蛋白質清除率在16.65%左右，黃傘燕麥發(fā)酵液的蛋白質清除率在18%左右，大杯傘燕麥發(fā)酵液蛋白質清除率在18%左右，灰樹花燕麥發(fā)酵液的蛋白質清除率在19%左右。

圖4 沖洗次數(shù)對不同發(fā)酵液蛋白清除率的影響Fig.4 Effect of the flushes frequency on the protein clearance rate of fermentation broth

2.3.3 醇沉的條件選擇

乙醇濃度對提取液中的多糖沉淀性質有很大的影響，這種影響大部分取決于多糖的相對分子質量和分子的結構等。多糖分子量越大，沉淀所需的乙醇濃度就越小，并且乙醇的濃度越高，糖得率就越高，相應的β-葡聚糖的得率也就越高，結果見表11。

表11 乙醇濃度對4種發(fā)酵液β-葡聚糖得率的影響Table 11 Effect of Ethanol concentration on β-Glucan yield of four fermentation broth

由表可知，當乙醇濃度達到60%的時候，β-葡聚糖已完全沉淀，乙醇的濃度升高，β-葡聚糖的得率僅有可忽略不計的增長，故在純化時，選擇濃度為60%進行醇沉。

2.4 β-葡聚糖分子量測定

用高效凝膠色譜法測得的3種β-葡聚糖的分子量，結果見圖5。

未經發(fā)酵的燕麥麩皮水提液純化出的燕麥β-葡聚糖的平均分子量為9.697×105。黃傘燕麥發(fā)酵純化出的β-葡聚糖的平均分子量為1.188×105，大杯傘麥發(fā)酵純化出的β-葡聚糖的平均分子量為2.279×105，灰樹花燕麥發(fā)酵純化出的β-葡聚糖的平均分子量3.516×105，平均分子量大小相比較經雙向發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖分子量大小明顯小于未經發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖。

2.5 發(fā)酵液中總糖、蛋白質含量測定

標準曲線為y=6.27x+0.258 4，R2=0.988 0?？偺菧y定結果見圖6。

圖5 不同發(fā)酵液中純化的β-葡聚糖分子量Fig.5 Molecular mass of different fermentation broth

圖6 發(fā)酵液總糖含量測定Fig.6 Content of total sugar of the fermentation broth

由圖6可知，雙向發(fā)酵后發(fā)酵液內總糖的含量比未經發(fā)酵的燕麥水提液含量高。未經發(fā)酵的燕麥水提液的總糖含量為11.375 g/L，黃傘燕麥發(fā)酵液總糖含量為18.05 g/L；大杯傘燕麥發(fā)酵液總糖含量為20.31 g/L，增加量最多；灰樹花燕麥發(fā)酵液總糖含量為16.82 g/L。經過純化之后的β-葡聚糖因去過淀粉并用乙醇沉淀之后，去除了大部分的糖所以總糖含量相對較少。未經發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.628 g/L；黃傘燕麥發(fā)酵β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.798 g/L，；大杯傘燕麥發(fā)酵β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.825 g/L；灰樹花燕麥發(fā)酵β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.704 g/L。

蛋白質含量測定結果見圖7。

圖7 發(fā)酵液及發(fā)酵純化后燕麥β葡聚糖蛋白質含量測定Fig.7 Content of the protein of the fermentation broth and the purified oat-β-Glucan

燕麥麩皮水提液與3種發(fā)酵液因未經過純化而相對蛋白質含量較高，且發(fā)酵后的蛋白質含量比水提液高，與未發(fā)酵水提液相比，灰樹花燕麥發(fā)酵液增加蛋白質的含量更加顯著，且隨著濃度逐漸升高蛋白質含量呈逐漸升高的趨勢，其次是大杯傘燕麥發(fā)酵液、黃傘燕麥發(fā)酵液。4種β-葡聚糖的水溶液因經過純化去蛋白而含量較少，但依舊存在，是因為蛋白酶將蛋白分解成小分子肽，分子量小且溶于水，所以在純化時不宜沉淀下來，仍可以檢測出，與未發(fā)酵燕麥β-葡聚糖相比，黃傘燕麥β-葡聚糖蛋白含量最高，其次是灰樹花燕麥β-葡聚糖、大杯傘燕麥β-葡聚糖。

3 結論

1）利用剛果紅法，從12種藥食用真菌中篩選出雙向發(fā)酵后能使β-葡聚糖總量增加最大的3種真菌，即黃傘、大杯傘、灰樹花，其發(fā)酵穩(wěn)定后發(fā)酵液中所含β-葡聚糖為未進行雙向發(fā)酵的燕麥水溶液中的β-葡聚糖含量的近2倍～3倍。

2）用1%的耐高溫α-淀粉酶在80℃去除淀粉30 min最為適宜，用seveg法除蛋白時sevage試劑中氯仿與正丁醇的比例為4∶1，sevage試劑的添加量為1/2，沖洗次數(shù)為2次時蛋白質的清除率達到穩(wěn)定，當乙醇濃度在60%時能將β-葡聚糖幾乎完全沉淀下來，醇沉2次效果更好。

3）經雙向發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖平均分子量明顯小于未經發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖?？偺羌暗鞍踪|含量發(fā)酵后比未經發(fā)酵的含量均升高。與未發(fā)酵水提液相比，灰樹花燕麥發(fā)酵液增加蛋白質的含量更加顯著，且隨著濃度逐漸升高蛋白質含量呈逐漸升高的趨勢，其次為大杯傘燕麥發(fā)酵液、黃傘燕麥發(fā)酵液。與未經發(fā)酵的燕麥水提液相比，大杯傘燕麥發(fā)酵液總糖增加量最多，其次為黃傘燕麥發(fā)酵液、灰樹花燕麥發(fā)酵液。