于 洋，史嘉翊，黃 珍，劉增瑞，吳 丹

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cell, HSC)的活化是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)是主要的致纖維化因子[2]，該細(xì)胞因子可以上調(diào)HSC合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellu-larmatrix, ECM)，是加速肝纖維化發(fā)生的主要因素。TGF-β的主要功能是維持免疫耐受和參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[3]，在肝纖維化發(fā)生時(shí)表達(dá)水平顯著增高。肝纖維化的過(guò)程是由多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路控制的結(jié)果，其中TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路是激活HSC促進(jìn)ECM生成的主要途徑。因此，以TGF-β為靶點(diǎn)，阻斷或調(diào)控該信號(hào)的傳導(dǎo)可為肝纖維化的防治研究提供新策略。

1 肝纖維化的發(fā)病機(jī)制

肝纖維化是肝臟內(nèi)彌漫性ECM異常增生[4]，我國(guó)該病的主要病因?yàn)椴《拘愿窝祝罅匡嬀萍伴L(zhǎng)期服用藥物也可誘發(fā)肝損傷，激活肝Kupffer細(xì)胞、血小板等分泌各種細(xì)胞因子，其中包括TGF-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)等，多種細(xì)胞因子共同作用介導(dǎo)HSC轉(zhuǎn)化為肝成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFB)，合成大量ECM，并逐漸沉積從而引起肝纖維化[5]。

2 TGF-β/Smad通路參與分子

2.1 TGF-β超家族TGF-β超家族由TGF-β、激活素(activin)、生長(zhǎng)分化因子(growth differentiation factor, GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenicprotein, BMP)等數(shù)十個(gè)成員組成，該家族成員在細(xì)胞增殖、凋亡、纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[6]。TGF-β是由位于N-末端的潛態(tài)相關(guān)肽(latency associated peptide, LAP)和C-末端成熟結(jié)構(gòu)域組成的大前體分子組成[7]。在這種前體中，LAP起著多功能肽的作用，能夠調(diào)節(jié)TGF-β1在整個(gè)發(fā)展過(guò)程中和維持成人組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最初，LAP的N末端附近的疏水殘基與成熟的TGF-β結(jié)合，LAP與成熟生長(zhǎng)因子經(jīng)Furin蛋白酶處理后非共價(jià)結(jié)合形成小潛在復(fù)合體(small latent complex,SLC)。在分泌過(guò)程中，LAP也與潛伏的TGF-β結(jié)合蛋白(latent TGF-β binding protein, LTBP)共價(jià)相互作用形成大的潛伏復(fù)合物(large latent complex, LLC)，并且以這種形式從細(xì)胞中分泌TGF-β，這個(gè)過(guò)程為T(mén)GF-β的活化[8]。在LTBPs不存在的情況下，LAP內(nèi)的反應(yīng)性半胱氨酸(Cys)與成熟TGF-β中的游離半胱氨酸形成不正確配對(duì)的二硫鍵，從而確保SLC以非活性形式分泌。TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)依賴(lài)于從LLC中釋放成熟的配體，這一過(guò)程通過(guò)激活劑如血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)等來(lái)介導(dǎo)[9]。

2.2 TGF-β超家族受體TGF-β由靶細(xì)胞膜特異性受體(TβR)介導(dǎo)，這些受體有一個(gè)富含半胱氨酸的胞外域，一個(gè)跨膜域和一個(gè)富含絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)的胞內(nèi)域。TβR存在著Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種形式，其中TβRⅠ、TβRⅡ型為信號(hào)傳遞受體，其跨膜區(qū)具有Ser/Thr蛋白激酶活性，在沒(méi)有配體的情況下，它們保持二聚體的形式，與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[10]。TGF-β配體與TβRⅡ在胞外端結(jié)合，TβRⅡ活化并激活TβRⅠ的GS區(qū)絲氨酸殘基，TβRⅠ磷酸化，并與配體形成異源三聚體復(fù)合物，從而使生物信號(hào)從細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)。TβRIII又稱(chēng)為Endoglin，CD105，本身缺乏蛋白激酶活性，為細(xì)胞膜糖蛋白，主要功能是調(diào)節(jié)受體與配體之間的相互作用，以及調(diào)節(jié)TβRⅡ在細(xì)胞膜的表達(dá)[11]，在TGF-β發(fā)揮生物學(xué)功能中起著主要作用。

2.3 Smads蛋白家族Smad蛋白位于TGF-β的下游，該蛋白作為中介將配體受體結(jié)合的信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad蛋白有保守的MHl和MH2區(qū)及連接兩者的連接區(qū)(linker)。Smad蛋白未激活時(shí)，MH1和MH2相互抑制，活化后MH2絲氨酸基序(SSXS)被磷酸化，可以解除二者之間的相互抑制[12]。Smad蛋白家族由9個(gè)成員組成，被分為3類(lèi)。第一類(lèi)是由Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9組成的受體調(diào)節(jié)型Smads(R-Smad)，可與活化的TβRⅠ直接作用并被磷酸化激活。NLS可使Smad蛋白向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，SSXS磷酸化后活化Smad蛋白。第二類(lèi)是共同調(diào)節(jié)型Smads(Co-Smad)，包括Smad4，不能和TβR結(jié)合，也不能被磷酸化，但能使Smad復(fù)合物保持有效的轉(zhuǎn)錄活性。第三類(lèi)為抑制性Smad(I-Smad)，包括Smad6和Smad7，與R-Smad結(jié)構(gòu)相似，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TβR-I，阻止R-Smad的磷酸化[13]。

3 肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的TGF-β/Smad通路

在TGF-β/Smad通路中，活化的TGF-β連續(xù)激活TβRⅠ、TβRⅡ，TβRⅠ使R-Smad磷酸化，構(gòu)型發(fā)生變化后與Co-Smad結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA結(jié)合，參與基因調(diào)控。同時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)表達(dá)降低，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)表達(dá)升高，使ECM合成增加而分解減少。肝臟可以產(chǎn)生纖溶酶原經(jīng)激活后變?yōu)槔w溶酶，進(jìn)一步激活MMPs，降解ECM。而TIMPs能特異性抑制MMPs的活性[6]。

3.1 Smad2/3磷酸化Smad2和Smad3是觸發(fā)TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵介質(zhì)所在，HSC上Smad2的缺失，可通過(guò)增加磷酸化、核轉(zhuǎn)運(yùn)等促進(jìn)Smad3相關(guān)的肝纖維化的進(jìn)展。Zhang L[14]等人在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，Smad2的過(guò)表達(dá)減弱了ColI和TIMP-1的產(chǎn)生，但增強(qiáng)了MMP-2的表達(dá)，而Smad3的過(guò)表達(dá)顯示相反的效果，最終導(dǎo)致ECM沉積。Smad2激活靶基因轉(zhuǎn)錄的前提是需要結(jié)合核DNA連接蛋白FAST-1。而Smad3可與DNA上的Smad結(jié)合元件(Smad-binding element, SBE)直接結(jié)合[15]。PPM1A蛋白是一種常見(jiàn)的Smad磷酸酶，具有鎂離子或錳離子依賴(lài)性，能在細(xì)胞核內(nèi)與磷酸化后的Smad2/3結(jié)合，從而終止TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。

3.2 對(duì)Smad7的研究Smad7是一種抑制性Smad蛋白，在多個(gè)途徑上抑制TGF-β信號(hào)通路。TGF-β刺激細(xì)胞后，mRNA和蛋白水平上調(diào)，Smad7蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGF-I型受體MH2結(jié)構(gòu)域的L3環(huán)阻斷R-Smad磷酸化并最終終止TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，Smad7還可以招募E3連接酶Smurf1/2或Nedd4-2到靶向活化的TGF-β受體，導(dǎo)致受體的泛素化降解[17]。

3.3 TGF-β/Smad通路與ADAMTS-2研究表明：凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)能夠介導(dǎo)TGF-β1的激活[18]，解整合素樣金屬蛋白酶-2(A Disintegrin and Metalloprotease with Thrombospondin Motif 2, ADAMTS-2)可通過(guò)TSP-1與間隔序列同ECM相黏附。ADAMTS-2能切割Ⅰ-Ⅲ型前膠原蛋白氨基端，將前膠原蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炷z原。TGF-β通過(guò)TGF-β/Smad通路上調(diào)ADAMTS-2的mRNA表達(dá)水平，從而促進(jìn)ADAMTS-2蛋白的釋放[19]。實(shí)驗(yàn)研究顯示與靜息的HSC相比，活化的HSC使ADAM-8,-9,-12,-28的mRNA表達(dá)增加[20]。敲除ADAMTS-2基因小鼠可有效對(duì)抗四氯化碳引起的肝纖維化[21]，因此ADAMTS-2及TGF-β可能存在協(xié)同致肝纖維化作用。

3.4 BMP7/Smad與TGF-β/SmadBMP7也屬于TGF-β超家族，TGF-β和BMP-7均為Smad信號(hào)通路的下游信號(hào)，二者相互調(diào)節(jié)，以平衡其生物活動(dòng)。BMP-7具有抗纖維化和抗炎作用，BMP-7結(jié)合BMP受體激活R-Smad1/5/8。磷酸化的R-Smads與Smad4形成異聚復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，誘導(dǎo)其靶基因的轉(zhuǎn)錄，還可以對(duì)miR-200和miR-29進(jìn)行調(diào)控，對(duì)纖維化有抑制作用[22]。

3.5 CTGF與TGF-β/Smad結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一種富含半胱氨酸的多肽，其具有促細(xì)胞增殖、遷移及分化作用，介導(dǎo)TGF-β的促細(xì)胞增殖及ECM的合成，與肝纖維化的形成有著密切關(guān)系。CTGF是TGF-β的下游反應(yīng)元件，TGF-β可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)CTGF的生成[23]。Holmes等[24]將各種CTGF/SMAD表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)成纖維細(xì)胞，觀察到轉(zhuǎn)染含Smad3和Smad4表達(dá)載體的細(xì)胞中CTGF表達(dá)顯著升高。研究顯示，CTGF siRNA對(duì)HSC的I、III型膠原的mRNA表達(dá)有明顯抑制作用[25]。

4 展望

研究表明，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是可逆的，對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)或阻斷是當(dāng)前肝臟疾病治療的重點(diǎn)[26]。在一定的條件下，可以通過(guò)抑制HSC的活化或促進(jìn)HSC的凋亡、增強(qiáng)膠原降解等逆轉(zhuǎn)該過(guò)程。肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程由多條信號(hào)通路共同參與，其中TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路已經(jīng)成為治療肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。當(dāng)前針對(duì)該通路治療肝纖維化的途徑主要有以下幾種：(1)減少TGF-β的表達(dá)與活化，可利用TGF-β抗體或TGF-β反義mRNA來(lái)阻止HSC分泌TGF-β；(2)作用于TGF-β受體的治療，阻斷TGF-β與受體結(jié)合[27]。HONG-CHUANG等[28]通過(guò)構(gòu)建不含胞內(nèi)激酶區(qū)外源性TβRⅡ，與內(nèi)源性TβRⅡ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體，作用于CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型。外源性的受體由于缺少胞內(nèi)激酶區(qū)，不能磷酸化，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不能下傳，從而阻斷其與TGF-β的結(jié)合，結(jié)果顯示TGF-βR-Ⅱ蛋白明顯阻止了大鼠肝纖維化的進(jìn)展，為肝纖維化及其他纖維化疾病的治療提供了可能；(3)針對(duì)TGF-β下游受體激酶信號(hào)傳導(dǎo)的治療。Dooley等[29]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制Smad2/3磷酸化，活化的Smad復(fù)合物的核移位和(CAGA)9-MLP-Luc的激活，阻斷TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)，理論上下調(diào)Smad2/3或上調(diào)Smad7均為可行的基因治療策略。CTGF是在TGF-β作用下HSC合成ColI的下游介導(dǎo)者，CTGF對(duì)HSC周期進(jìn)程無(wú)影響，作用比較單一，主要介導(dǎo)TGF-β的促纖維化作用，并且只局限于結(jié)締組織，靶向CTGF抗纖維化的治療可能更有效[30]。

綜上所述， TGF-β/Smad信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著尤為關(guān)鍵的作用。以該通路為靶點(diǎn)，阻斷通路中的某一環(huán)節(jié)進(jìn)而阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外肝纖維化治療的研究重點(diǎn)。隨著研究人員對(duì)肝纖維化機(jī)制的不斷深入研究，相信有更多的抗肝纖維化靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，為肝纖維化治療提供新的思路。