沈春玉 趙玉巧

摘要?為研究天然防腐劑對調(diào)理石斑魚腐敗菌的抑菌效果，對調(diào)理石斑魚的腐敗菌進行分離純化，選擇能適應(yīng)低溫環(huán)境或能產(chǎn)生芽孢的腐敗菌作為試驗菌。使用濾紙片法測定乳酸鏈球菌素、茶多酚、聚賴氨酸對試驗菌的抑菌效果，同時采用平板培養(yǎng)法測定天然防腐劑對試驗菌的最低抑菌濃度（MIC）。試驗結(jié)果表明，乳酸鏈球菌素對7種試驗菌都有抑菌效果，茶多酚對5種試驗菌有抑菌效果，聚賴氨酸對3種試驗菌有抑菌效果。乳酸鏈球菌素對試驗菌中革蘭氏陽性菌抑菌效果最好，其中對S-3、S-9、S-11和S-13的MIC分別為0.1、0.4、0.5、0.4 mg/mL;茶多酚對S-3、S-5、S-8、S-10和S-11的MIC分別為0.5、8.0、2.0、0.5、1.0 mg/mL。聚賴氨酸對試驗菌S-5、S-8和S-10的MIC分別為2.5、1.5、2.0 mg/mL。

關(guān)鍵詞?調(diào)理石斑魚;腐敗菌;抑菌;最低抑菌濃度

中圖分類號?S?986文獻標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.054

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Studyon the Isolation and Bacteriostasis of Spoilage Bacteria Bacteria from the Prepared Grouper Products

SHEN Chun?yu，ZHAO Yu?qiao?（College of Marine Life and Fisheries，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang，Jiangsu 222005）

Abstract?In order to study the natural preservatives effect on the spoilage bacteria from the prepared grouper products，the spoilage bacteria of the prepared grouper products were isolated and purified，and the spoilage bacteria that can adapt to low temperature environments or produce spores were selected as experimental bacteria.Using filter paper method to determine the antibacterial effect of nisin，tea polyphenols and polylysine on spoilage bacteria.At the same time，the minimum inhibitory concentration （MIC） of natural preservatives against spoilage bacteria was determined by plate culture method.The experimental results showed that nisin had antibacterial effect on 7 experimental bacteria.Tea polyphenol had antibacterial effect on 5 experimental bacteria，and polylysine had antibacterial effect on 3 experimental bacteria.Nisin had the best antibacterial activity against gram?positive bacteria in the experimental bacteria，and the MIC for S-3，S-9，S-11 and S-13 were 0.1，0.4，0.5，0.4 mg/mL.The MIC of tea polyphenols on S-3，S-5，S-8，S-10 and S-11 were 0.5，8.0，2.0，0.5 and 1.0 mg/mL.The MIC of polylysine against experimental bacteria S-5，S-8 and S-10 were 2.5，1.5 and 2.0 mg/mL.

Key words?Prepared grouper products;Spoilage bacteria;Bacteriostasis;MIC

調(diào)理石斑魚產(chǎn)品以石斑魚為原料，經(jīng)過一定加工步驟后，以包裝的形式在冷藏（4 ℃）的條件下儲存和販賣，可直接食用或食用前只需要簡單加工或熱處理。該產(chǎn)品采用低熱強度滅菌技術(shù)以保證產(chǎn)品良好的風(fēng)味，但是該技術(shù)使產(chǎn)品滅菌不徹底，在儲存和販賣的過程中，產(chǎn)品中殘留的細菌就會在適合的條件下生長繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，限制產(chǎn)品發(fā)展。目前，該產(chǎn)品腐敗微生物的控制技術(shù)成為產(chǎn)品發(fā)展的關(guān)鍵問題，而產(chǎn)品腐敗菌的分離及抑菌研究是這個問題得以解決的基礎(chǔ)[1]。

在控制產(chǎn)品腐敗微生物方面，陳佳麗等[2]研究了香辛料對燒雞中分離的腐敗菌的抑制作用;駱琦[3]從燒雞老湯中篩選了一株耐熱芽孢菌，研究了一系列抑菌方法;馬含笑等[4]研究了Nisin、聚賴氨酸、單辛酸甘油酯和殼聚糖對腐敗醬豬肝中分離出的3株污染微生物的抑制作用;白艷紅[5]從低溫熏煮香腸中優(yōu)勢腐敗菌的角度出發(fā)，研制成功了2種復(fù)配生物型抑菌劑，延長了低溫熏煮香腸貨架期。

以上有關(guān)產(chǎn)品腐敗微生物的分離及抑菌研究方面較少，有關(guān)調(diào)理石斑魚產(chǎn)品腐敗菌的分離及抑菌鮮見。筆者從調(diào)理石斑魚產(chǎn)品中分離出腐敗微生物，靶向選擇芽孢菌或能夠在低溫儲藏條件下生長良好的2類影響產(chǎn)品品質(zhì)關(guān)鍵菌種作為試驗菌，體外研究天然防腐劑[6-8]對試驗菌的抑菌作用，選出高效天然防腐劑，旨在為調(diào)理石斑魚產(chǎn)品提供防腐理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

石斑魚（連云港三開食品有限公司）;乳酸鏈球菌素（浙江銀象生物工程有限公司）;茶多酚（萬利達生物科技有限公司）;聚賴氨酸（河南萬邦實業(yè)有限公司）。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[9]和芽孢培養(yǎng)基[10]。

1.2?方法

1.2.1?石斑魚預(yù)處理。將新鮮程度不同的原料石斑魚分成2組，新鮮度如表1所示，第1組去鱗、去腮、去內(nèi)臟（“三去”）后立即取魚肉部分培養(yǎng);第2組“三去”后油炸、包裝，30 ℃加速培養(yǎng)3 d。

1.2.2?調(diào)理石斑魚腐敗微生物的分離和初步鑒定。

使用平板計數(shù)法分離調(diào)理石斑魚腐敗微生物，根據(jù)肉眼觀察菌落形態(tài)、菌落顏色、隆起狀態(tài)、邊緣和表面狀態(tài)，挑選出存在差異的菌落[11]，將其編號并且記錄形態(tài)、顏色、狀態(tài)等。對挑選出的菌落進行革蘭氏染色和芽孢染色[9]的初步鑒定。

1.2.3?不同溫度下腐敗微生物的生長。

將腐敗微生物接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別置于5、10、15、20 ℃溫度下培養(yǎng)，觀察10 d內(nèi)菌株生長情況。

1.2.4?菌懸液的制備。

從菌種保藏斜面上取適量菌，研磨洗入15 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻，菌懸液濃度為107 CFU/mL。

1.2.5?濾紙片法抑菌試驗。配制5 mg/mL的乳酸鏈球菌素、茶多酚、聚賴氨酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。同時配制相同濃度的3種溶液，于121 ℃滅菌20 min后使用。

將滅菌后的Φ6 mm濾紙片置于防腐液中浸泡5 min，貼于涂有0.1 mL菌懸液的細菌平板上，同種菌株做2組平行樣。將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出，測量抑菌圈大小。

1.2.6?乳酸鏈球菌素MIC的測定。

配制含乳酸鏈球菌素濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，滅菌后倒30 mL該培養(yǎng)基于含有菌懸液的平板中混合均勻，每個菌株做2個平行，將平板放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，觀察菌株生長情況，將沒有菌生長的該乳酸鏈球菌素濃度牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為MIC。

1.2.7?茶多酚MIC的測定。

配制含茶多酚濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，試驗方法同“1.2.6”。

1.2.8?聚賴氨酸MIC的測定。

配制含聚賴氨酸濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，試驗方法同“1.2.6”。

2?結(jié)果與分析

2.1?調(diào)理石斑魚腐敗微生物菌落形態(tài)

從圖1所示的菌相中挑選出13種腐敗微生物，菌落形態(tài)結(jié)果如表2所示，S-1～S-12為第1組預(yù)處理石斑魚中挑選出的菌落，S-13為第2組加速培養(yǎng)油炸石斑魚中挑出的菌落。

將這13種菌落劃線分離純化，得到單菌落形態(tài)與初始記錄相符合，對其進行初步的革蘭氏染色、芽孢染色及鏡檢[12]。圖2分別是編號為S-5號和S-10號的菌種劃線分離單菌落形態(tài)圖。

2.2?腐敗微生物菌種的鏡檢結(jié)果統(tǒng)計

13種腐敗微生物鏡檢結(jié)果統(tǒng)計如表3所示，其中球菌較多，S-13能夠產(chǎn)生芽孢。有資料顯示[13-14]，大部分芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢抵抗性較強，耐高溫，能夠在較高溫度下存活，是導(dǎo)致滅菌食品腐敗變質(zhì)的主要原因，且有些芽孢桿菌會在食品中產(chǎn)生毒素，從而造成腹瀉、嘔吐等不良癥狀。選擇S-13為抑菌試驗菌株。

2.3?不同溫度下腐敗微生物生長結(jié)果

由表4可知， S-3、S-5、S-8、S-9、S-10和S-11能夠在5 ℃良好生長。由于調(diào)理石斑魚產(chǎn)品的儲藏和運輸條件為4 ℃左右，因此能夠在5 ℃左右生長良好的菌種會在儲藏和運輸過程中導(dǎo)致調(diào)理石斑魚產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)[15]。故將該6種能夠低溫生長的菌種選為部分試驗菌。

2.4?天然防腐劑的抑菌效果

由表5可知，乳酸鏈球菌素對S-3、S-9、S-11和S-13抑菌圈大，對S-5、S-8、S-10抑菌圈較小，結(jié)合表2結(jié)果說明乳酸鏈球菌素對革蘭氏陽性菌抑菌效果極好，對革蘭氏陰性菌抑菌效果不明顯，這與他人研究的乳酸鏈球菌素對革蘭氏陰性菌幾乎無抑菌效果的結(jié)果相符合[16]。茶多酚對S-3、S-10和S-11也有較大的抑菌圈，對S-5和S-8的抑菌圈小;聚賴氨酸僅對S-8有較大的抑菌圈，對S-5和S-10的抑菌圈小。比較三者，乳酸鏈球菌素對試驗菌抑菌譜更廣，屬于高效天然防腐劑，茶多酚其次。

2.5?高壓滅菌處理對天然防腐劑抑菌活性的影響

將表6與表5對比可知，表6中乳酸鏈球菌素的抑菌圈比表5小很多，高溫處理乳酸鏈球菌素不穩(wěn)定，降低了其對試驗菌的抑菌效果;茶多酚的抑菌圈大小稍有變化，說明其熱穩(wěn)定性一般;聚賴氨酸的抑菌圈大小幾乎無變化，說明聚賴氨酸具有熱穩(wěn)定性[17]。

2.6?乳酸鏈球菌素MIC的測定

從表7可以看出，乳酸鏈球菌素對S-3的MIC為0.1 mg/mL，對S-9的MIC為0.4 mg/mL，對S-11的MIC為0.5 mg/mL。繼續(xù)增加乳酸鏈球菌素濃度會超過食品添加劑最大允許添加量，而且乳酸鏈球菌素對革蘭氏陰性菌抑菌效果不好，故未對S-5、S-8、S-10進一步測定MIC。乳酸鏈球菌素對該研究試驗菌的MIC均高于呂志飛等[18]研究的乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的MIC，是因為菌種及研究方法不同，該研究以平板中是否生長菌為標(biāo)準(zhǔn)測定MIC比液體培養(yǎng)測OD值法更為可靠。

2.7?茶多酚MIC的測定

從表8可以看出，茶多酚對S-3和S-10的MIC為0.5 mg/mL，對S-5的MIC為8.0 mg/mL，對S-8的MIC為2.0 mg/mL，對S-11的MIC為1.0 mg/mL。與李柯欣[19]研究結(jié)果的茶多酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC分別為0.25、8.00、10.00 mg/mL相差不大。由于茶多酚對試驗菌的MIC均超過食品添加劑最大允許添加量，在后續(xù)研究中可配合其他高效防腐劑應(yīng)用于產(chǎn)品，降低其使用量。

2.8?聚賴氨酸MIC的測定

從表9可以看出，聚賴氨酸對S-5的MIC為2.5 mg/mL，對S-8的MIC為1.5 mg/mL，對S-10的MIC為2.0 mg/mL。有研究報道稱[20]，聚賴氨酸作為一種天然防腐劑，抑菌譜廣，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、酵母菌以及霉菌等都有較好的抑制作用。其抑菌譜雖廣，但也不能全部抑制，其能抑制的調(diào)理石斑魚產(chǎn)品中試驗菌較少，故后續(xù)不考慮其在調(diào)理石斑魚產(chǎn)品中的應(yīng)用。

3?結(jié)論

由于石斑魚生長環(huán)境溫度低，其攜帶的微生物也適宜低溫生長，且石斑魚營養(yǎng)豐富，魚體捕撈死亡后，其攜帶微生物迅速繁殖，因而從調(diào)理石斑魚中挑選出的13種腐敗微生物中，能夠低溫生長的菌株占比較多。挑選出的7種試驗菌產(chǎn)芽孢或能夠在5 ℃生長的特性，使得這7種腐敗菌在調(diào)理石斑魚產(chǎn)品生產(chǎn)和儲存過程中占有優(yōu)勢，極易引起產(chǎn)品腐敗，影響產(chǎn)品發(fā)展。

天然防腐劑體外抑菌試驗表明，乳酸鏈球菌素對試驗菌具有廣譜抑菌性，乳酸鏈球菌素對革蘭氏陽性菌試驗菌S-3、S-9、S-11和S-13的MIC分別為0.1、0.4、0.5、0.4 mg/mL，都在食品添加劑最大添加范圍內(nèi);茶多酚對抑菌效果緊隨其后，對試驗菌S-3、S-5、S-8、S-10和S-11的MIC分別為0.5、8.0、2.0、0.5、1.0 mg/mL;聚賴氨酸抑菌效果最差，對試驗菌S-5、S-8和S-10的MIC分別為2.5、1.5、2.0 mg/mL。選擇乳酸鏈球菌素和茶多酚這2種高效天然防腐劑做后續(xù)研究。

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