荊半夏組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化

駱淑媛 宋薇 樊康華 鄧麗娟

摘要：以荊半夏的葉片、葉柄及塊莖為材料，實(shí)驗研究了不同激素濃度對半夏組織培養(yǎng)的影響。實(shí)驗結(jié)果表明;在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，葉片最易誘導(dǎo)形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%;塊莖次之，愈傷組織誘導(dǎo)率為90%;葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為70腸，且容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。而由葉片所形成的愈傷組織接種到MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/ NAA分化培養(yǎng)基中，出芽率最高，達(dá)100%，且試管苗長勢旺盛;半夏最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA。此研究有助于建立一套完整的荊半夏組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為湖北地區(qū)特色經(jīng)濟(jì)藥用植物荊豐夏的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：半夏;組織培養(yǎng);愈傷組織

中圖分類號：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）22-0195-03

1 引言

半夏是天南星科半夏屬，多年生草本藥用植物，廣泛分布于全國各地，具有抗癌、抗心律不齊等功效[1，2]。然而由于過度采挖及盲目引種，野生半夏的自然資源幾近枯竭，品質(zhì)和數(shù)量亦有所降低[3]。而通過組織培技術(shù)獲得的半夏具有生長速度快、半夏品質(zhì)高等特點(diǎn)，因此采用組織培養(yǎng)方式進(jìn)行半夏的大規(guī)模生產(chǎn)已逐漸成為目前發(fā)展的趨勢[4]。本研究取材自野生的荊半夏，就其組培過程中外植體的選擇、培養(yǎng)基的激素配比等方面對荊半夏的快速繁殖的影響展開研究，為荊半夏種植資源選育、保存及開發(fā)利用提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

野生荊半夏。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)材料的消毒

將塊莖洗凈，削皮，葉片和葉柄不削皮，自來水沖洗5min后，用蒸餾水沖洗3次，然后用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，最后用0.1%升汞溶液消毒8min后，用無菌水沖洗7次備用。

2.2.2 外植體的接種及誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒好的半夏塊莖于培養(yǎng)皿中切成約5mm×5mm的薄片;葉片切成約5mm×5mm大小;葉柄切成約5mm小段。然后將不同來源的外植體分別接種到MS+2.0mg/1.6-BA+0.5mg/ 1，NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每組外植體分別接種20管，于26℃培養(yǎng)，光照周期12h/d，光照強(qiáng)度2000～3000lux。

2.2.3 分化培養(yǎng)

將愈傷組織切成約5mm×5mm小塊，分別接種到4種不同激素配比的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基分別接種20管。

2.2.4 生根培養(yǎng)

將無根組培苗接種到4種不同激素配比的培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基分別接種20管。

3 結(jié)果與分析

3.1 半夏不同外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將半夏的塊莖、葉片和葉柄進(jìn)行消毒處理后，分別接種到MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7d后，外植體的切口處膨大;25 d后，3種外植體均誘導(dǎo)產(chǎn)生了黃綠色的愈傷組織（圖1）。其中，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%;塊莖愈傷組織誘導(dǎo)率為90%;葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為70%（表1），并且部分葉柄在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐化情況，褐化率為20%。因此，在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，半夏葉片最易誘導(dǎo)形成愈傷組織，其次是塊莖。

3.2 半夏葉片愈傷組織的分化培養(yǎng)

將葉片誘導(dǎo)所形成的愈傷組織分別接種到4種不同激素配比的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。15d后，葉片愈傷組織分化率均達(dá)到90%以上。其中，在1號培養(yǎng)基中，發(fā)芽率為95%，但平均出芽數(shù)最高，達(dá)2.11個;而在4號培養(yǎng)基中，發(fā)芽率最高，達(dá)到100%，平均出芽數(shù)為1.92個，與最高出芽數(shù)差異不大，而且其分化形成的試管苗長勢最為旺盛（表2）。綜上所述，半夏葉片最佳分化培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA。

3.3 半夏組培苗的生根培養(yǎng)

挑選生長旺盛的組培苗，接種到4種不同激素配比的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。15d后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用0.3mg/L NAA分化培養(yǎng)基時，生根率為80%，但長出的根相對較短、較細(xì);在0.3mg/LNAA基礎(chǔ)上加人了0.2mg/L 6-BA時，生根高達(dá)100%，而且此時平均根長也達(dá)到最高，為2.73cm（表3）。但是當(dāng)進(jìn)一步提高NAA濃度時，生根率和根長反而有所下降（表3）。這表明半夏組培苗的最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L6-BA+0.3mg/L NAA;而且在生根培養(yǎng)過程中，NAA的濃度對植物的生根影響很大，尤其在低濃度時，在促進(jìn)根的生長上起主導(dǎo)作用。

4 討論

在組織培養(yǎng)過程中，由于外植體本身所具有的特性因子，會很大程度上決定其培養(yǎng)結(jié)果，因此，選擇合適的外植體十分重要[5]。在半夏的組織培養(yǎng)過程中，一般會選用葉片、葉柄、塊莖、莖尖以及珠芽等作為外植體[6～8]，但關(guān)于最佳外植體的篩選，目前的研究結(jié)果存在一定的差異。吳能表等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)于重慶的三葉半夏的塊莖、葉片和葉柄接種于MS+1.5mg/LKT+2.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L IAA中誘導(dǎo)培養(yǎng)，均形成白色愈傷組織，其中葉柄的誘導(dǎo)形成愈傷組織的效率最高，達(dá)100%;葉片次之，為85%;塊莖最低，愈傷組織誘導(dǎo)率僅為50%。喻娜等[10]發(fā)現(xiàn)，以MS+0.2mg/L 2，4-D+1.0mg/L KT誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)于四川的野生旱半夏的葉片，其愈傷誘導(dǎo)率達(dá)98.3%;而采用MS+0.2mg/L2，4-D+0.5mg/L KT誘導(dǎo)葉柄，其愈傷誘導(dǎo)率達(dá)91.8%，葉片更利于愈傷組織誘導(dǎo)。而在本研究中，野生荊半夏的塊莖、葉片和葉柄在MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)形成黃綠色愈傷組織，其中葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%，與喻娜等研究結(jié)果基本一致。這表明，半夏品系及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織的形成有較大的影響。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是影響植物細(xì)胞分裂、愈傷組織誘導(dǎo)、再生植株形成的重要因素，因此生長激素和細(xì)胞分裂素濃度配比是決定組培成功的關(guān)鍵[11，12]。在半夏快繁技術(shù)中，一般多采用KT、2，4-D、IAA、IBA和GA3等多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。在本研究中，我們嘗試采用NAA代替2，4—D，并配合6—BA使用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將由葉片誘導(dǎo)所形成的的愈傷組織接種于MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA培養(yǎng)基中，出芽率可達(dá)100%，而將試管苗接種于生根培養(yǎng)基MS+0.2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率也可高達(dá)100%。這表明，在半夏組織培養(yǎng)過程中，6-BA和NAA配比使用，也能達(dá)到較好的組培效果，長出健壯的半夏試管苗（圖2）。但是，在此條件下培育的荊半夏，其藥理活性成分和含量能否與野生荊半夏一致，則有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2019-10-22

基金項目：湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：201811798012）

作者簡介：駱淑媛（1972-），女，實(shí)驗師，研究方向為生物技術(shù)。

通訊作者：鄧麗娟（1974-），女，副教授，博士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。