胡 賽，黃瑞雪，周平坤，黃 波

（1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)421001；2.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙410078；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京市放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

自1979年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)p53基因以來(lái)，不斷研究發(fā)現(xiàn)，由P53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，同時(shí)在細(xì)胞放射損傷反應(yīng)中如肺組織上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1-2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，IncRNA）是長(zhǎng)度＞200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA［3］。lncRNA 在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮作用［4］。近期研究表明，細(xì)胞照射后，部分lncRNA 表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，上調(diào)或下調(diào)的lncRNA 分子對(duì)被照射細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和多種蛋白產(chǎn)生具有調(diào)控作用［5］。國(guó)內(nèi)有關(guān)實(shí)驗(yàn)室前期識(shí)別鑒定了正常人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D及其α粒子誘發(fā)癌變細(xì)胞BERP35T-1和BERP35T-4 細(xì)胞之間的差異表達(dá)lncRNA［6］。鑒于p53 在肺上皮細(xì)胞功能中的重要調(diào)控作用，以及前期發(fā)現(xiàn)p53 和某些lncRNA 之間存在互相影響、互相調(diào)控的關(guān)系［7-8］，推測(cè)受到照射的上皮細(xì)胞出現(xiàn)的顯著差異表達(dá)的lncRNA 中，有一部分可能與p53相關(guān)聯(lián)，參與細(xì)胞放射損傷反應(yīng)如多種與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路并發(fā)揮作用。因此，本研究使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除人肺支氣管上皮細(xì)胞HBE的p53 表達(dá)，進(jìn)行照射，芯片檢測(cè)構(gòu)建lncRNA 差異表達(dá)譜，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以揭示放射誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等細(xì)胞放射損傷反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，對(duì)今后臨床放射治療中避免發(fā)生正常組織放射性損傷具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

正常人支氣管上皮HBE細(xì)胞（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)）。DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司）；胎牛血清（美國(guó)Sigma 公司）；注射用硫酸鏈霉素（深圳華藥南方制藥有限公司）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；THUNDERBIRD SYBR qRTPCR Mix（CodeNo.QPS-201）（日本東洋紡生物科技有限公司）；兔抗人P53 單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；兔抗人GAPDH 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）（美國(guó)Thermo公司）；RT-PCR儀（MyCycler）（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HBE 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為飽和濕度、37℃和5%CO2。

1.3 60Co γ射線照射和樣品收集

待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%接觸密度，設(shè)立HBE p53表達(dá)野生型（HBEp53-wt）細(xì)胞和p53敲除的HBE（HBEp53-/-）細(xì)胞，室溫下給予4 Gy60Co γ 射線照射，照射前30 min換新鮮培養(yǎng)基。照射后置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h 后收集細(xì)胞，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗2 遍，加Trizol裂解，置于-80℃冰箱保存。

1.4 基因敲除載體構(gòu)建

由上海合生生物公司完成。HBEp53-/-細(xì)胞的構(gòu)建參考美國(guó)麻省理工學(xué)院張峰教授實(shí)驗(yàn)室CRISPRCas9 基因編輯實(shí)驗(yàn)方案［9］，利用在線設(shè)計(jì)工具（http：//crispr.mit.edu/）設(shè)計(jì)針對(duì)p53基因的小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）并在上、下游引物添加相應(yīng)的堿基。sgRNA 退火形成雙鏈后與經(jīng)過(guò)BbsⅠ酶切的Lenti-Cas9-gRNA 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，挑克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定并選取正確克隆，獲得基因敲除載體。p53 基因敲除細(xì)胞HBEP53-/-由北京合生基因科技有限公司構(gòu)建。

1.5 Western印跡法檢測(cè)p53敲除效率

HBEp53-/-細(xì)胞構(gòu)建后，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并定量。采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HBEp53-wt細(xì)胞和HBEp53-/-細(xì)胞P53蛋白表達(dá)水平。

1.6 lncRNA芯片雜交和基因差異表達(dá)分析

lncRNA 芯片雜交反應(yīng)和分析由歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。提取樣品總RNA，使用試劑盒ribo-zero試劑消化核糖體RNA后，加入切割試劑將RNA 切割成短片段，以切割后的RNA 為模板，用6堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA；在cDNA 二鏈合成時(shí)以dUTP 代替dTTP，然后連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP 的1 條鏈進(jìn)行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA 一鏈；使用試劑盒純化cDNA一鏈；純化的cDNA一鏈再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)檢合格后，使用Illumina Hiseg 4000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。使用R語(yǔ)言進(jìn)行l(wèi)ncRNA 差異表達(dá)分析、差異基因表達(dá)水平聚類分析和火山圖分析。

1.7 lncRNA預(yù)測(cè)靶基因的功能分析

lncRNA 預(yù)測(cè)靶基因的功能分析包含GO 富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。GO功能富集分析的方法：將全部蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本作為背景列表，差異蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本列表作為從背景列表中篩選出來(lái)的候選列表，利用超幾何分布檢驗(yàn)計(jì)算代表GO 功能集在差異蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本列表中是否顯著富集的P 值。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白編碼基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，并用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)信號(hào)通路條目中差異基因富集的顯著性。計(jì)算的結(jié)果會(huì)返回一個(gè)富集顯著性的P值，P＜0.05表示差異基因在該信號(hào)通路中出現(xiàn)了富集。信號(hào)通路分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有提示的作用，通過(guò)差異基因的信號(hào)通路分析，可以找到富集差異基因的信號(hào)通路條目，尋找不同樣品的差異蛋白編碼基因可能與哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平

按照THUNDERBIRD SYBR qRT-PCR Mix 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。實(shí)時(shí)定量RT-PCR 反應(yīng)完成后，保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的相對(duì)lncRNA的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 p53敲除效率驗(yàn)證

Western印跡法分析結(jié)果顯示，與HBEp53-wt細(xì)胞相比，HBEp53-/-細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)顯著降低（圖1）。

2.2 lncRNA表達(dá)譜的變化

Fig.1 Verification of p53 knockout efficiency in p53 knockout HBE（HBEp53-/-）cells established by CRlSPRCas9. HBEp53-wt：p53 wild type HBE cells.

通過(guò)芯片篩選4 Gy 照射后HBEp53-wt細(xì)胞和HBEp53-/-細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)多個(gè)lncRNA 的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著性差異改變，其中有239個(gè)上調(diào)表達(dá)，287個(gè)下調(diào)表達(dá)。

lncRNA 表達(dá)譜的聚類分析結(jié)果如圖2A所示，與HBEp53-wt細(xì)胞相比，HBEp53-/-細(xì)胞下調(diào)表達(dá)的lncRNA 數(shù)量略多于上調(diào)表達(dá)的數(shù)量（P＜0.05）。lncRNA 表達(dá)譜分析的火山圖結(jié)果所示，顯著性下調(diào)表達(dá)的lncRNA數(shù)量（綠色）略多于顯著性上調(diào)表達(dá)的數(shù)量（P＜0.05）（灰色為表達(dá)水平無(wú)顯著性差異）?？梢姡鹕綀D的結(jié)果和聚類分析的結(jié)果基本吻合。

與受照射HBEp53-wt細(xì)胞相比，受照射HBEp53-/-細(xì)胞中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)表達(dá)排名前10的lncRNA分子見表1和表2。從表1可見，ENST00000651681上調(diào)倍數(shù)最高，達(dá)到6.43 倍；其次是NR_037600.1，上調(diào)倍數(shù)為6.27倍。從表2可見，ENST00000366397下調(diào)倍數(shù)最大，為6.30倍；其次是ENST00000520590，下調(diào)倍數(shù)為6.19倍。

2.3 差異表達(dá)lncRNA的GO分析

圖3 展示了差異表達(dá)水平改變?cè)谇?0 位的lncRNA 調(diào)控靶基因的GO 分析結(jié)果。GO 分析包含生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能等3 方面。生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的前10 位lncRNA 靶基因主要涉及溫度穩(wěn)態(tài)、負(fù)調(diào)控產(chǎn)熱、負(fù)調(diào)控多細(xì)胞生物體的代謝過(guò)程、正調(diào)控腎上腺素能受體信號(hào)通路和正調(diào)控泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性等；細(xì)胞成分結(jié)果顯示，差異表達(dá)的前10 位lncRNA靶基因主要涉及包被蛋白復(fù)合體囊泡包被、順面高爾基體網(wǎng)絡(luò)和高爾基-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中間體成分和第二步驟催化反應(yīng)拼接體等；而分子功能分類結(jié)果顯示，主要涉及β3腎上腺素受體結(jié)合蛋白、酪氨酸激酶活性蛋白、DNA結(jié)合蛋白、鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白、突觸融合蛋白結(jié)合蛋白和泛素結(jié)合蛋白等。

Fig.2 Cluster analysis and volcano maps of differentially expressed long non-coding RNAs（lncRNAs）in irradiated HBEp53-/-cells. Cells were treated with 4 Gy，the expression lncRNAs chip analysis was performed 4 h post-irradiation. A：cluster analysis，pink means up-regulation，purple means downregulation；B：volcano map，red dots mean up-regulation，green dots mean down-regulation，gray dots mean no change.log2fold=log2（expression level of HBEp53-/-/expression level of HBEp53-wt）.

Tab.1 Top ten up-regulated lncRNAs sassociated with p53 deficiency in irradiated HBEp53-/-cells

Tab.2 Top ten down-regulated lncRNAs sassociated with p53 deficiency in irradiated HBEp53-/-cells

Fig.3 GO analysis of differentially expressed lncRNA in HBEp53-wt and HBEp53-/- cells after irradiation treatment.See Fig.2 for the cell treatment.

2.4 差異表達(dá)lncRNA的KEGG分析

圖4 顯示了差異表達(dá)lncRNA 調(diào)控靶基因的KEGG 分析結(jié)果。從生物體系統(tǒng)通路劃分，有感知、神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌、環(huán)境適應(yīng)、發(fā)育和循環(huán)系統(tǒng)等；從代謝劃分，有外源物的生物降解、核苷代謝、維生素和輔助因子代謝、脂質(zhì)代謝和能量代謝等；人類疾病相關(guān)的通路與上述生物體系統(tǒng)通路基本吻合；細(xì)胞過(guò)程通路有轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增長(zhǎng)和死亡等。

Fig.4 KEGG analysis of targeted genes of differentially expressed lncRNA associated with p53 deficiency in HBEp53-wt and HBEp53-/-cells after irradiation treatment. See fig.2 for the cell treatment.Pink horizontal bar：cellular processes-related signaling pathways；blue horizontal bar：environmental information processing-related signaling pathways；cyan horizontal bar：genetic information processing-related signaling pathways；green horizontal bar：human diseases-related signaling pathways；brown horizontal bar：metabolism-related signaling pathways；red horizontal bar：organism systems-related signaling pathways.

2.5 差異表達(dá)lncRNA的實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證芯片結(jié)果，分別選取上調(diào)和下調(diào)表達(dá)變化前5的lncRNA分子利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。芯片結(jié)果中參與上調(diào)表達(dá)的ENST00000651681，NR_037600.1，ENST00000420335，ENST000006-10086和ENST00000635508分子，實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果（圖5A）均出現(xiàn)上調(diào)變化。芯片結(jié)果中參與下調(diào)表達(dá)的ENST00000366397，ENST00000520590，ENST00000624128，ENST00000652722 和NR_110099.1分子，實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果（圖5B）均出現(xiàn)下調(diào)變化。提示芯片結(jié)果可靠。

Fig.5 Verification of differential expression of lncRNAs from microarray analysis. See Fig.2 for the cell treatment. The top five of up-regulated（A）and down-regulated lncRNAs（B）were selected respectively，and performed by real time RT-PCR assay.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HBEp53-wt group.

3 討論

近期針對(duì)p53 與lncRNA 相互作用的研究報(bào)道逐漸增多，主要集中在與p53 依賴相關(guān)的lncRNA在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等中的作用。Mello等［10］使用染色質(zhì)免疫共沉淀與高通量測(cè)序相結(jié)合的方法，聯(lián)合RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集，識(shí)別出一個(gè)受p53 調(diào)控的新lncRNA，即Neat1，發(fā)現(xiàn)Neat1 具有抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌癥起始的功能。Zhu 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，lncRNAMEG3 能促進(jìn)p53 轉(zhuǎn)錄活性，lncRNAMEG3 能與P53蛋白的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)生交互作用，引起P53 下游眾多靶基因表達(dá)發(fā)生改變。Chaudhry［12］使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了人TK6 細(xì)胞（p53 表達(dá)的淋巴母細(xì)胞）和WTK1（p53 不表達(dá)的淋巴母細(xì)胞）經(jīng)過(guò)照射后小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）的變化，發(fā)現(xiàn)在p53 表達(dá)的TK6 細(xì) 胞 中，SNHG1，SNHG6 和SNHG11 等snoRNA 表達(dá)水平升高；而在p53 不表達(dá)的WTK1細(xì)胞中，SNHG 和SNHG11 表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明照射后細(xì)胞中部分lncRNA 的表達(dá)改變可能與p53 有關(guān)，也是細(xì)胞對(duì)外界放射性損傷反應(yīng)的一種調(diào)控方式，也提示p53 和lncRNA 可能在照射后的細(xì)胞反應(yīng)中共同發(fā)揮作用。有研究報(bào)道，肺上皮細(xì)胞受照射后，lncRNA 也出現(xiàn)相應(yīng)改變。本研究通過(guò)敲除肺支氣管上皮細(xì)胞HBE的p53基因表達(dá)，利用芯片雜交技術(shù)，分析敲除p53 后細(xì)胞放射損傷應(yīng)答lncRNA的差異表達(dá)譜變化。本研究設(shè)計(jì)上與之前報(bào)道不同的地方，一是使用CRISPR-cas9技術(shù)敲除HBE細(xì)胞上的p53表達(dá)；二是采用了人正常肺上皮細(xì)胞HBE。采用這2 點(diǎn)的原因主要是想了解p53缺失的情況下，肺上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 在照射后的變化。另外，擬通過(guò)這種方法構(gòu)建p53 依賴性的放射損傷反應(yīng)細(xì)胞模型，以便為今后開展放射性纖維化的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。P53 是DNA 損傷的關(guān)鍵蛋白，其損傷或缺失會(huì)直接影響放射所致的DNA 損傷應(yīng)答和修復(fù)信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，照射后微小lncRNA miR-34a 過(guò)表達(dá)，通過(guò)抑制其靶基因p53 的表達(dá)從而降低其下游的DNA 同源重組修復(fù)基因RAD51 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞自發(fā)DNA 雙鏈斷裂損傷殘留增加［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBEp53-/-細(xì)胞受輻照損傷后，多種lncRNA 分子出現(xiàn)顯著差異變化。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的lncRNA 參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能和多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路。如負(fù)調(diào)控多細(xì)胞生物體的代謝過(guò)程、正調(diào)控腎上腺素能受體信號(hào)通路和正調(diào)控泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、調(diào)控順式高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、參與維生素和輔助因子、內(nèi)分泌、免疫、脂質(zhì)代謝通路等。有研究報(bào)道，腎上腺素能受體信號(hào)通路參與調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，如去甲腎上腺素能夠誘導(dǎo)Slug 和Snail 蛋白表達(dá)，刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1分泌，促進(jìn)細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。β 腎上腺素能受體拮抗劑心得安能抑制去甲腎上腺素的上述作用［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在HBE 細(xì)胞放射損傷反應(yīng)中，調(diào)控腎上腺素能受體信號(hào)通路的lncRNA 分子（XR_001738079.2，XR_001738080.2和TCONS_00008371）表達(dá)出現(xiàn)變化。推測(cè)這些lncRNA 可能在輻照后，在p53 的調(diào)控作用下，對(duì)腎上腺素能受體產(chǎn)生作用，從而激活或抑制下游一系列與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因表達(dá)，最終影響上皮間充質(zhì)變化的進(jìn)程，這為揭示電離輻射誘發(fā)細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了新的信息。

總之，p53作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)控其下游編碼蛋白的功能靶基因轉(zhuǎn)錄活性，在細(xì)胞放射損傷反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究表明，p53 還可通過(guò)調(diào)控多個(gè)lncRNA 分子的表達(dá)變化，繼而影響下游功能靶基因的轉(zhuǎn)錄活性及相應(yīng)信號(hào)通路，同樣發(fā)揮對(duì)細(xì)胞放射損傷應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控作用。這些基于lncRNA 芯片分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)手段，發(fā)掘出來(lái)的p53相關(guān)的放射損傷響應(yīng)lncRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)信息，對(duì)今后生物研究放射損傷反應(yīng)機(jī)制具有一定價(jià)值。但是，具體功能還需進(jìn)一步在細(xì)胞水平甚至動(dòng)物水平上進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證預(yù)測(cè)分析的結(jié)果。

本研究的不足之處在于采用的是單一劑量4 Gy照射，未探討細(xì)胞p53缺失受多個(gè)劑量輻射后的lncRNA 變化是否與照射劑量有關(guān)。另外，本研究?jī)H用1種肺上皮細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證分析，這對(duì)芯片測(cè)序結(jié)果的解讀可能有一定影響。

綜上所述，本研究表明，HBEp53-/-細(xì)胞受4 Gy γ射線照射后lncRNA 表達(dá)發(fā)生變化，并對(duì)差異表達(dá)顯著的lncRNA 分子的生物學(xué)功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，為今后進(jìn)一步研究p53 和lncRNA 在細(xì)胞放射損傷反應(yīng)中的作用提供了基礎(chǔ)信息。