葉 程，曹 睿，宋文憑，張玉民，樊慧蓉，劉鑒峰，李 亮，邵榮光

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津300192）

雙靶向配體化力達(dá)霉素（dual targeting ligandbased lidamycin，DTLL）是在強(qiáng)效抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素（又稱C-1027）［1-2］輔基蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過(guò)生物工程技術(shù)改造得到的，具有靶向表皮生長(zhǎng)因子受體和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2功能的力達(dá)霉素衍生物，其相對(duì)分子質(zhì)量約19 000［3］。實(shí)驗(yàn)證明，DTLL在多種腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，較之力達(dá)霉素可以顯著提升對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，同時(shí)，制備工藝成熟穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用前景［4-6］。因此，觀察DTLL在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征及分布和排泄數(shù)據(jù)，對(duì)該藥的后續(xù)研究和臨床試驗(yàn)申報(bào)具有重大參考意義。

放射性同位素示蹤法是將蛋白質(zhì)類(lèi)藥物通過(guò)同位素標(biāo)記后給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用以檢測(cè)藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的血藥濃度變化以及分布代謝情況的方法，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)［7］。本研究中采用的放射性同位素125I具有半衰期適中、易于標(biāo)記和檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。本研究將［125I］DTLL iv 給予大鼠后，檢測(cè)血漿中放射性濃度并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步分析DTLL 在大鼠體內(nèi)的分布和排泄，為下一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

健康Wistar 大鼠，雌性170～260 g，雄性280～300 g，SPF級(jí)（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所制備的DTLL 凍干粉針，批號(hào)P10327 和P20327，純度＞95%；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2470型γ計(jì)數(shù)儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；Ultimate3000 型高效液相色譜（美國(guó)Dionex 公司）；Mini-scan TLC 薄層放射性掃描儀（美國(guó)BIOSCAN公司）。

1.2 ［125I］DTLL的制備

采用氯胺T 法將125I 標(biāo)記于DTLL 蛋白上，經(jīng)Sephadex G-50 凝膠純化，洗脫液為50 mmol·L-1PBS（pH7.4），連續(xù)收集［125I］DTLL峰洗脫液。

1.3 標(biāo)記率的測(cè)定

在硅膠板的初始端點(diǎn)2 μL標(biāo)記樣品進(jìn)行層析，展開(kāi)劑為乙醇∶水=9∶1（V/V）。至距離硅膠板末端約2 cm處停止，利用薄層放射性掃描儀檢測(cè)標(biāo)記物的標(biāo)記率。

1.4 放射化學(xué)純度測(cè)定

分別收集純化樣品2 μL 進(jìn)行層析，展開(kāi)劑為乙醇∶水=9∶1（V/V）。至距離硅膠板末端約2 cm處停止，利用薄層放射性掃描儀檢測(cè)純化后標(biāo)記物的放射化學(xué)純度。

1.5 血清樣品制備

健康Wistar 大鼠6 只，雌雄各半，尾靜脈注射［125I］DTLL，給藥劑量2625 kBq·0.05 mg-1·kg-1。于iv 給藥后0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12 和24 h，從眼眶后靜脈叢取血約300 μL，離心分離血清。吸取血清樣品100 μL置于離心管中，加入三氯醋酸400 μL，振蕩搖勻，離心后分別取上清液以及下層沉淀，測(cè)定放射性活度。

1.6 組織分布測(cè)定

健康Wistar 大鼠24 只，雌雄各半，隨機(jī)分成4 組，每只大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL，給藥劑量2625 kBq·0.05 mg-1·kg-1。分別于給藥后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0.083，0.5，3 和6 h）眼眶后靜脈叢取血并處死大鼠，立即解剖，分別取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌肉、脂肪、生殖腺和淋巴結(jié)。將上述組織稱重，用生理鹽水充分浸泡后剪碎制成勻漿，取100 μL勻漿加入三氯醋酸400 μL，振蕩搖勻，離心后分別取上清液以及下層沉淀，測(cè)定放射性活度。

1.7 糞便和尿液排泄測(cè)定

健康Wistar大鼠12只，雌雄各半，分成2組，給藥前自由進(jìn)食與飲水，每只大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL，給藥劑量2625 kBq·0.05 mg-1·kg-1。將大鼠置于代謝籠中，分別收集給藥后0～3，3～5，5～7，7～11，11～24，24～48，48～72，72～96，96～120，120～144 和144～168 h 各時(shí)間段內(nèi)的尿樣及糞樣，記錄尿樣體積，稱糞便質(zhì)量，直接測(cè)定放射性活度。

1.8 膽汁排泄測(cè)定

取健康Wistar大鼠6只，雌雄各半，給藥前自由進(jìn)食與飲水。大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉，實(shí)施膽汁插管引流手術(shù)后，每只大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL，給藥劑量2625 kBq·0.05 mg-1·kg-1。分別于給藥后0～1，1～2，2～3，3～4，4～5，5～6，6～7，7～8，8～9，9～10，10～11，11～12和12～24 h收集全部膽汁樣品，并直接測(cè)定放射性活度。計(jì)算膽汁中藥物的排泄量、累積排泄量和累積排泄分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 ［125I］DTLL放射化學(xué)純度和標(biāo)記率

將125I 標(biāo)記DTLL 后的混合液，經(jīng)Sephadex G-50 凝膠純化得到［125I］DTLL（圖1），標(biāo)記率為92.52%（圖2）。根據(jù)薄層放射性掃描儀的測(cè)定結(jié)果和積分結(jié)果，測(cè)得第9～12 管純化后的［125I］DTLL 的放射化學(xué)純度均＞99%，且混合后［125I］DTLL 的放射化學(xué)純度為98%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求（圖3）。樣品總放射性濃度為2.35×107kBq·L-1，蛋白質(zhì)濃度為447.7 mg·L-1，比放射性活度（總放射性濃度/蛋白質(zhì)濃度）為5.25×107kBq·g-1蛋白。

Fig.1 Purification of125I-labeled dual target ligandbased lidamycin([125I]DTLL)by Sephadex G-50 column.Reaction mixture of [125I] DTLL was transferred to the Sephadex G-50 column for purification. The eluent was PBS (50 mmol·L-1,pH 7.4). The flow rate was 1.0 mL·min- 1. The radioactivity of effluent was detected in every each milliliter.

Fig.2 Detection of isotope labeling yield of［125I］DTLL by thin-layer chromatograph. Labeling yield was calculated according to the determination results and integral results of thin-layer radioactive scanner.

Fig.3 Detection of radiochemical purity of［125I］DTLL by thin-layer chromatograph. Radiochemical purity was calculated according to the determination results and integral results of thin-layer radioactive scanner.

2.2 大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

大鼠尾靜脈給藥后，通過(guò)測(cè)定的三氯醋酸沉淀放射性和總放射性，分別計(jì)算對(duì)應(yīng)的藥物濃度。結(jié)果表明，三氯醋酸沉淀放射性和總放射性藥物濃度變化趨勢(shì)一致，均隨著給藥時(shí)間的增加而逐漸降低，但總放射性計(jì)算得到的藥物濃度遠(yuǎn)高于三氯醋酸沉淀放射性計(jì)算得到的藥物濃度（圖4）。分別以總放射性與三氯醋酸沉淀放射性計(jì)算［125I］DTLL的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，并通過(guò)藥動(dòng)學(xué)軟件以非房室模型計(jì)算參數(shù)（表1）。在主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中，與體內(nèi)暴露量密切相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如AUC0-t，AUC0-∞，MRT0-t和t1/2的總放射性均高于酸沉放射性，而與體內(nèi)分布和清除相關(guān)的Vd和Cl 則是三氯醋酸沉淀放射性高于總放射性。

Fig.4 Concentration-time curves of［125I］DTLL in plasma of rats after iv administration. Wistar rats were iv administred with［125I］DTLL 0.05 mg·kg-1.The blood sample was collected before administration and after 0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12 and 24 h of administration. Total radio-activity was determined by LSC.［125I］DTLL concentration（ng·Eq·mL-1）=Measured radioactivity/decay coefficient/total radioactivity of［125I］DTLL solution/0.1×1000.，n=6.

Tab.1 Pharmacokinetic parameters of [125I] DTLL in rats after iv administration

2.3 大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL 后的全身組織放射性分布

大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL 后對(duì)各組織/血清中放射性進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，大鼠尾靜脈注射給藥后，酸沉部分和總放射部分放射性在大鼠體內(nèi)主要臟器的分布范圍基本一致，廣泛分布于各組織中，但在血液以及肺、肝等血流豐富的臟器中，總放射性濃度均高于酸沉部分放射性濃度，表明對(duì)應(yīng)組織的放射性可能是由血液中游離125I 造成的（圖5）；在比較0～6 h 內(nèi)主要臟器的酸沉部分藥物濃度后發(fā)現(xiàn)，DTLL 在主要臟器中均未隨時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生蓄積的情況，其中大部分臟器給藥后放射性分布逐漸降低，而心臟和胃壁在給藥后3 h 達(dá)到峰值（表2）。

Fig.5 Tissue distribution of［125I］DTLL in rats 6 h after iv administration. See Fig.4 for the rat treatment. Tissues were collected after 6 h of administration.［125I］DTLL concentration（μg·Eq·kg-1）=Measured radioactivity/decay coefficient/0.7/30/tissue mass/（total radioactivity of DTLL solution/0.7/30/1000）.，n=6.

2.4 大鼠尾靜脈注射［125I］DTLL后的放射性排泄

大鼠iv 給予［125I］DTLL 后繪制累積排泄曲線。在168 h 內(nèi)經(jīng)尿液排泄的累積排泄分?jǐn)?shù)為（82.5±2.6）%，經(jīng)糞便排出的累積排泄分?jǐn)?shù)為（10.4±6.6）%，累積尿糞排泄的放射量達(dá)到給藥劑量的（92.9±7.4）%（圖6），而0～24 h 內(nèi)經(jīng)膽汁排泄的放射劑量?jī)H為總劑量的（3.37±2.1）%（圖7）。以上結(jié)果表明，糞便和尿液是［125I］DTLL 主要的排泄途徑。

Tab.2 Tissue distribution of DTLL in rats after iv administration

Fig.6 Accumulated excretion curves of rats urine and excrement after［125I］DTLL administration. See Fig.4 for the rat treatment. Urine and feces were collected at 0-3，3-5，5-7，7-11，11-24，24-48，48-72，72-96，96-120，120-144 and 144-168 h after administration.Urine excretion amount=radioactivity of 1 mL urine×urine volume（cpm）；feces excretion amount=total measured solid radioactivity（cpm）. Biles were collected at 0-1，1-2，2-3，3-4，4-5，5-6，6-7，7-8，8-9，9-10，10-11，11-12 and 12-24 h after administration.，n=6.

Fig.7 Accumulated excretion curve of rat bile after［125I］DTLL administration. See Fig.4 for the rat treatment.Biles were collected at 0-1，1-2，2-3，3-4，4-5，5-6，6-7，7-8，8-9，9-10，10-11，11-12 and 12-24 h after administration.Excretion rate（%）=excretion amount/dosage×100%.，n=6.

3 討論

大分子藥物進(jìn)入體內(nèi)后的分布和排泄過(guò)程通常比較復(fù)雜，通常會(huì)以降解產(chǎn)物的形式，經(jīng)肝腎代謝等途徑排出體外。因此，針對(duì)大分子藥動(dòng)學(xué)研究所選的方法，應(yīng)能將進(jìn)入體液的藥物及其降解、代謝產(chǎn)物與內(nèi)源性物質(zhì)區(qū)別開(kāi)來(lái)，以排除干擾物等可能產(chǎn)生的干擾［8］。放射性同位素125I 具有半衰期適中，易于標(biāo)記和檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，既可以避免血液中雜質(zhì)對(duì)結(jié)果測(cè)定的干擾，同時(shí)又可以簡(jiǎn)化樣品處理和檢測(cè)過(guò)程、縮短實(shí)驗(yàn)周期。因此，在蛋白類(lèi)藥物的藥動(dòng)學(xué)研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

125I 標(biāo)記的外源性蛋白或多肽在進(jìn)入體內(nèi)生理?xiàng)l件的影響下后可能被降解脫碘，因此直接檢測(cè)血液中放射性活度并不能準(zhǔn)確反映藥物的血藥濃度。本研究首先比較了血清總放射性和三氯醋酸沉淀放射性的差異，通過(guò)比較，將血清樣品中的［125I］DTLL 與分解游離的125I 區(qū)分開(kāi)。結(jié)果顯示，［125I］DTLL 進(jìn)入體內(nèi)后很可能被降解并釋放出游離125I。因此，以三氯醋酸沉淀組放射性值計(jì)算得到的數(shù)值理論上更接近實(shí)際情況。值得注意的是，大分子生物制品的表觀分布容積Vd與血漿容積相近，如貝伐珠單抗、英利昔單抗和利多昔單抗等，單劑量的（Vd）均在10～30 mL·kg-1之間；而本研究中大鼠iv給予［125I］DTLL 后的藥物Vd值達(dá)到了（1598±391）mL·kg-1，推測(cè)其原因可能是DTLL不會(huì)與血漿蛋白或其他非特異性靶標(biāo)結(jié)合，但能與靶標(biāo)組織特異性的結(jié)合，導(dǎo)致其Vd相對(duì)較大。

劉有平等［9］曾對(duì)小鼠靜脈注射力達(dá)霉素的體內(nèi)血清動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察。在同等給藥劑量下，經(jīng)三氯醋酸沉淀處理后，力達(dá)霉素原型藥物的AUC0-24h為57.5 h·μg·L-1，t1/2為2.78 h。將力達(dá)霉素藥動(dòng)學(xué)結(jié)果與本研究的大鼠iv 給予［125I］DTLL 的結(jié)果相比，相對(duì)應(yīng)的參數(shù)差異不大。而且Richter 等［10］證實(shí)，生物大分子藥物的藥動(dòng)學(xué)特征相對(duì)單一，個(gè)體差異小，易于進(jìn)行種屬外推和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)。因此推測(cè)，力達(dá)霉素經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造后得到的DTLL 的藥動(dòng)學(xué)特征未發(fā)生明顯改變。當(dāng)然，由于生物大分子藥物存在抗原性，為進(jìn)一步觀察其不同種屬間差異，后續(xù)仍需采用非嚙齒類(lèi)動(dòng)物（如犬、豬或恒河猴等）對(duì)DTLL的藥動(dòng)學(xué)特征加以深入研究。

而［125I］DTLL 在動(dòng)物體內(nèi)分布研究證明，經(jīng)iv給藥后，［125I］DTLL 在肺、腎和心臟等組織中分布含量較高，與上述表征分布特征的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的結(jié)果相吻合。而在給藥72 h后，腎和心臟中分布仍能保持在較高水平。其中腎的藥物濃度與其余組織相比高出數(shù)倍，但隨著時(shí)間的推進(jìn)，腎中藥物濃度呈下降趨勢(shì)，表明DTLL可以通過(guò)腎消除，但不會(huì)在腎中蓄積；心臟中的藥物濃度隨時(shí)間不同呈不規(guī)律分布，但因濃度較低，因此也可排除其蓄積趨勢(shì)；其余組織均呈下降趨勢(shì)且含量較低，可以推定不會(huì)在這些組織中引起蓄積；腦中藥物含量極低，提示可能血腦屏障阻礙了DTLL進(jìn)入腦部。

大分子藥物通常不會(huì)以原型藥物形式排泄出體外，而是在體內(nèi)環(huán)境中被進(jìn)一步降解代謝為氨基酸、多肽或小分子產(chǎn)物，經(jīng)腎濾過(guò)或膽汁排泄出體外［11］。因此本研究采用測(cè)定總放射性來(lái)估算DTLL及其降解產(chǎn)物的總排泄量。排泄研究結(jié)果顯示，168 h內(nèi)經(jīng)尿液和糞便的排泄量達(dá)給總給藥劑量的（92.9±7.4）%，而從膽汁排出的放射性僅占給藥劑量的（3.4±2.1）%。表明DTLL 主要從腎排泄，其次為腸道排泄。上述結(jié)果提示，經(jīng)iv給藥后，DTLL在大鼠體內(nèi)可被快速消除，無(wú)蓄積風(fēng)險(xiǎn)，為DTLL后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。