杜婷婷，李軍*，曹春莉，陳銘，徐麗紅，馬婷，王甲嘉，葛肖艷，劉閃閃，童瑾

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲科,新疆 石河子832008;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,新疆 石河子832008;3 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，新疆 石河子832008)

慢性肝臟疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病，可引起持續(xù)、反復(fù)的肝實(shí)質(zhì)炎癥以及壞死，使肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積而降解不足進(jìn)而形成肝纖維化[1-2]。門靜脈壓隨著肝硬化程度的加重而增加、升高。肝靜脈壓力梯度(Hepatic Venous Pressure Gradient，HVPG)、術(shù)中游離門靜脈壓(Free Portal Pressure，F(xiàn)PP)是公認(rèn)的評(píng)價(jià)門靜脈壓力的可靠指標(biāo)[3]，但是HVPG及 FPP 的檢測(cè)具有侵入性，對(duì)患者的要求較高，很難在臨床大規(guī)模應(yīng)用，尤其是偏遠(yuǎn)地區(qū)。因此非侵入性、簡(jiǎn)單易行、診斷效能高的門靜脈壓力評(píng)估方法成為近年的研究的熱點(diǎn)。

聲脈沖輻射力彈性成像(Acoustic Radiation Force Impulse Elastography，ARFI)[4-6]作為一種新的彈性成像技術(shù)，它通過(guò)測(cè)量感興趣區(qū)(Region of Interest,ROI)的剪切波速度(Shear Wave Velocities,SWV)來(lái)評(píng)估組織彈性，即組織的硬度或質(zhì)地，已廣泛應(yīng)用腹部及淺表器官疾病的定性診斷。超聲造影(Contrast Enhanced Ultrasound，CEUS)在超聲醫(yī)學(xué)中占有重要的地位，可以清楚地顯示組織微小血管內(nèi)的血流灌注，增加圖像的可分辨清晰度，增加超聲病變檢出率及對(duì)慢性肝病發(fā)生纖維化診斷的敏感性和特異性[7-8]。

本研究構(gòu)建了不同程度的兔肝纖維化模型，進(jìn)行ARFI和CEUS檢查，將此兩種方法獲得的影像學(xué)參數(shù)與所測(cè)FPP進(jìn)行對(duì)照研究，研究各參數(shù)與FPP的相關(guān)性，尋找能較準(zhǔn)確評(píng)價(jià)FPP的參數(shù)，并獲取該參數(shù)的截?cái)嘀担瑸榕R床診斷及治療PHT提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 兔肝纖維化模型的建立方法

選用健康新西蘭大白兔44只，隨機(jī)抽取8只作為對(duì)照組，背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液，剩余36只作為實(shí)驗(yàn)組，背部皮下注射純CCl4，2次/周，共16周，起始劑量為0.3 mL/kg，3周后增加劑量為0.4 mL/kg，5周后增加劑量為0.5 mL/kg，此后維持劑量在0.5 mL/kg。

1.2 聲脈沖輻射力彈性成像技術(shù)(ARFI)檢測(cè)活體及離體兔肝硬度的方法

活體兔聲脈沖輻射力彈性成像技術(shù)(ARFI)檢測(cè)使用西門子公司生產(chǎn)的Acuson S 2000彩色多普勒超聲診斷儀，9 L4探頭，頻率4～9 MHz，配置VTQ定量分析系統(tǒng)，探查深度0.5～4 cm，于第一次造模后第4、6、8、10、12、14周，分別從實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取3～6只新西蘭大白兔，對(duì)照組隨機(jī)選取1只，第16周處死剩余實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兔，所有需行檢查的兔當(dāng)日禁食水、空腹8 h，8%水合氯醛鹽溶液2 mL/kg耳緣靜脈緩慢推注進(jìn)行麻醉。麻醉后進(jìn)行固定，充分暴露其腹部送至腹部彩超室接受檢查。由同1名高年資超聲醫(yī)師對(duì)所有受試兔進(jìn)行常規(guī)超聲檢查及ARFI檢查，記錄肝臟大小、邊緣狀態(tài)、實(shí)質(zhì)回聲、肝動(dòng)脈、門靜脈、肝靜脈的血流方向及速度等情況，在二維超聲的基礎(chǔ)上，采用ARFI技術(shù)檢測(cè)兔肝臟橫向剪切波速度SWV(m/s)。待兔門靜脈壓力測(cè)量完成后，利用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，并快速結(jié)扎兔肝臟血管及周圍韌帶并游離出兔肝臟，然后取出兔肝進(jìn)行ARFI檢測(cè)，離體兔肝剪切波速度記為SWV1，感興趣區(qū)域(ROI)的選擇應(yīng)避開肝內(nèi)管道系統(tǒng)，取樣深度為0.5～2 cm，檢測(cè)10次，最后取平均值。

1.3 超聲造影技術(shù)(CEUS)檢測(cè)兔肝血流動(dòng)力學(xué)方法

使用日立Ascendus(日本Hitachi公司)超聲診斷儀，L52線振探頭(頻率3～7 MHz)，造影軟件為EZU-CH9，造影劑采用SonoVue。

全部聲學(xué)造影檢測(cè)為具備10年以上工作經(jīng)驗(yàn)的腹部超聲醫(yī)生完成，ARFI檢查結(jié)束后，先行常規(guī)二維超聲及彩色多普勒超聲檢查，在兔肝臟尋找一個(gè)能同時(shí)包含有肝動(dòng)脈、肝靜脈及門靜脈的切面并開啟造影模式，在開始注射造影劑的同時(shí)開始錄像并計(jì)時(shí)，持續(xù)錄像3 min。將感興趣區(qū)域(ROI)放在兔肝實(shí)質(zhì)、門靜脈、肝靜脈以及肝動(dòng)脈上。對(duì)于血管，始終使ROI保持在血管結(jié)構(gòu)內(nèi)，對(duì)于肝實(shí)質(zhì)，放置在距離超聲探頭1～4 cm的深度，同時(shí)避開肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)。

超聲造影錄像中前5 s的平均值被定義為基線強(qiáng)度。肝靜脈到達(dá)時(shí)間(HVAT)、肝動(dòng)脈到達(dá)時(shí)間(HAAT)、門靜脈到達(dá)時(shí)間(PVAT)被定義為相應(yīng)ROI內(nèi)注射時(shí)間點(diǎn)至強(qiáng)度達(dá)到基線值的10%以上的時(shí)間間隔[7]。

PSI是肝實(shí)質(zhì)達(dá)峰強(qiáng)度與基礎(chǔ)強(qiáng)度的差值。PV-HAAT(即PVAT減去HAAT所得值)、HV-HAAT(即HVAT減去HAAT所得值)被計(jì)算出以減少人為以及血液循環(huán)時(shí)間不同所造成的影響。超聲造影分析的主要方法如圖1所示。

A—造影基礎(chǔ)圖像； B—造影劑到達(dá)肝動(dòng)脈圖像(箭頭);C—造影劑到達(dá)門靜脈圖像(箭頭);D—造影劑到達(dá)肝靜脈圖像(箭頭)圖1 肝纖維化F3期兔的超聲造影圖(肝動(dòng)脈、門靜脈和肝靜脈到達(dá)時(shí)間分別為4、5、7秒)Fig.1 The arrival time of hepatic artery(portal vein and hepatic vein was 4 seconds,5 seconds,7 seconds for New Zealand rabbit of cirrhosis,respectively)

1.4 兔術(shù)中游離門靜脈壓力(FPP)測(cè)量方法

兔完成CEUS檢測(cè)后，消毒后經(jīng)上腹部肋骨下緣切口進(jìn)腹，游離韌帶后選擇一支較粗的大網(wǎng)膜上的靜脈進(jìn)行FPP測(cè)量，充分暴露并游離好該靜脈，然后將一根靜脈輸液管內(nèi)注滿生理鹽水并與靜脈留置針相連，同時(shí)夾閉輸液管末端，將靜脈留置針刺入已游離好的靜脈并進(jìn)行固定，將輸液管垂直提起，并開放輸液管的末端，至輸液管中液體自然下落并處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，選取腰椎前緣水平為“0”點(diǎn)，進(jìn)行液面高度測(cè)量，所測(cè)量的高度值就是門靜脈自由壓(cmH2O)。

1.5 兔肝纖維化病理分期診斷方法

兔Masson染色后的切片均由病理科主治醫(yī)師及以上職稱的醫(yī)生獨(dú)立盲法閱片診斷，分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Metavir分期法[9](2000年全國(guó)病毒性肝炎病理診斷標(biāo)準(zhǔn))。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同肝纖維化病理分期組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，各組均數(shù)間的比較采用最小顯著差值法(Least-Significant Difference，LSD)。采用Spearman相關(guān)、Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT與LF病理分期以及FPP的相關(guān)性。。利用曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)驗(yàn)證ARFI技術(shù)和CEUS技術(shù)參數(shù)診斷門靜脈壓力的效果。以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兔肝纖維化病理學(xué)分期結(jié)果

病理檢查結(jié)果示：對(duì)照組兔肝臟病理學(xué)檢查均正常；36只實(shí)驗(yàn)組最終造模成功32只，肝纖維化分期為F1期6只、F2期10只、F3期8只、F4期8只，伴有或不伴炎癥壞死，造模成功率為88.89%(32/36)，各分期病理如圖2所示。

A—對(duì)照組；B—F1期；C—F2期；D—F3期；E—F4期；Masson染色(×40)圖2 兔肝纖維化病理分期Masson染色病理表現(xiàn)(×40)Fig.2 Pathological fibrosis staging in rabbits’liver tissue by Masson staining with a magnification(×40)

2.2 聲脈沖輻射力彈性成像技術(shù)(ARFI)評(píng)估兔門靜脈壓力結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的肝纖維化各分期彈性參數(shù)SWV、SWV1檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，各組間彈性參數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)(表1)。

表1 兔纖維化各分期彈性參數(shù)(SWV、SWV1)組間比較結(jié)果Tab.1 The value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

注：a、b、c、d、e分別表示與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組F1期、F2期、F3期、F4期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

與肝纖維化病理分期及實(shí)際所測(cè)門靜脈壓力值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，研究彈性成像參數(shù)對(duì)于判斷肝纖維化程度及門靜脈壓力的相關(guān)性。各纖維化分期FPP測(cè)量所得值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

注：a、b、c、d分別表示與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組F1期、F2期、F3期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。圖3 各纖維化病理分期兔游離門靜脈壓的比較Fig.3 The copmparison of FPP in different stages of liver fibrosis

Spearman相關(guān)分析顯示SWV、SWV1、FPP均與LF分期相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.935、0.921、0.940(P<0.001)(表2)。SWV、SWV1與FPP的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.857、0.947，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表2)。FPP和SWV、SWV1的線性相關(guān)關(guān)系(圖4)。

表2 SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT、LF分期與FPP的相關(guān)性Tab.2 The correlation among the SWV,SWV1,HVAT,HV-HAAT,stages of LF and FPP

注：*表示采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析。

圖4 SWV、SWV1與FPP之間相關(guān)性的散點(diǎn)圖Fig.4 The scatter plot of the SWV,SWV1 and FPP

2.3 超聲造影技術(shù)(CEUS)評(píng)估兔門靜脈壓力結(jié)果

應(yīng)用CEUS技術(shù)，通過(guò)監(jiān)測(cè)造影劑在肝內(nèi)的循環(huán)時(shí)間獲取肝臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)：肝動(dòng)脈灌注時(shí)間、門靜脈灌注時(shí)間、肝靜脈灌注時(shí)間、肝實(shí)質(zhì)峰值強(qiáng)度等。本次研究共記錄并分析了HVAT、HV-HAAT、HAAT、PAVT、PSI等超聲造影參數(shù)，結(jié)果可見(jiàn)不同纖維化程度組間HVAT、 HV-HAAT 參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)，而HAAT、PVAT未見(jiàn)差異(表3)。與肝纖維化病理分期及實(shí)際所測(cè)門靜脈壓力值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，研究造影參數(shù)對(duì)于判斷門靜脈壓力的相關(guān)性。Spearman相關(guān)分析顯示HVAT、HV-HAAT與LF分期相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.986、-0.842(P<0.001)(表2)。HVAT、HV-HAAT與FPP的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.587、-0.652，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，(表2)。FPP和HVAT、HV-HAAT的線性相關(guān)關(guān)系如圖5所示。

表3 不同肝纖維化程度兔的CEUS參數(shù)比較Tab.3 The comparison of CEUS parameters of different liver fibrosis degree

注：a、b、c、d、e分別表示與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組F1期、F2期、F3期、F4期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

圖5 HVAT、HV-HAAT與FPP之間相關(guān)性的散點(diǎn)圖Fig.5 The scatter plot of the HVAT,HV-HAAT and FPP

3 討論

PHT是慢性肝臟疾病和肝硬化的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥，肝病患者門靜脈壓力的改變常常伴隨著較多異常的臨床表現(xiàn)。因此，準(zhǔn)確評(píng)估PHT對(duì)評(píng)估患者疾病狀態(tài)和預(yù)后至關(guān)重要[10-11]，肝靜脈壓力梯度(HVPG)、術(shù)中游離門靜脈壓(FPP)的測(cè)量是評(píng)價(jià)門脈高壓是否存在和嚴(yán)重程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但HVPG的測(cè)量并不是在所有的中心都可以開展，而且這種技術(shù)是侵入性的，有些患者并不愿意接受。更為重要的，臨床上需要用可重復(fù)的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)療效。ARFI技術(shù)可以用于肝臟硬度參數(shù)SWV和SWV1的測(cè)量，CEUS技術(shù)可以用于肝血管和肝組織的血流灌注參數(shù)的測(cè)量。因此，探討ARFI、CEUS技術(shù)評(píng)價(jià)門靜脈壓力具有一定的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示新西蘭大白兔經(jīng)ARFI技術(shù)檢測(cè)彈性參數(shù)SWV與肝纖維化程度正相關(guān)(P<0.001)。在超聲造影中，隨著肝纖維化的加重，僅HVAT、HV-HAAT兩個(gè)參數(shù)在評(píng)價(jià)肝硬化(F=4)時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著肝纖維化的加重逐漸減少，其余參數(shù)(HAAT、PVAT、PSI)在本次研究中未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HVAT、HV-HAAT發(fā)生變化的主要理論基礎(chǔ)是肝纖維化過(guò)程中假小葉形成以及門靜脈的壓力增高，由于動(dòng)靜脈分流和毛細(xì)血管動(dòng)脈化，導(dǎo)致HV-HAAT在嚴(yán)重纖維化(F≥3)時(shí)明顯縮短。Augustin等[12]報(bào)道，隨著肝纖維化的加劇，門靜脈壓力越來(lái)越高，肝臟硬度也逐漸增大。有研究表明，慢性肝病患者的門靜脈高壓的嚴(yán)重程度與一些CEUS參數(shù)密切相關(guān)，如HVAT、HV-HAAT[13-14]，提示CEUS可能用于門靜脈壓力的評(píng)估。本次研究通過(guò)分析上述參數(shù)與FPP的相關(guān)性，旨在尋找可以有效、無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)肝纖維化過(guò)程中患者門靜脈壓力的新方法。本次實(shí)驗(yàn)采用導(dǎo)管法測(cè)量兔FPP，結(jié)果表明，雖然病理纖維化分期組間FPP僅在F4期與其他各期時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是可以看出隨著肝纖維化的加重，F(xiàn)PP也逐漸增大。這與Zhai L等[15]一項(xiàng)關(guān)于CEUS技術(shù)評(píng)估犬肝纖維化過(guò)程中門靜脈壓力改變的研究結(jié)果相似。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT及LF分期與FPP均具有相關(guān)性(r=0.857、0.947、-0.587、-0.652、0.940，P均<0.001)，隨著SWV、SWV1的增高，F(xiàn)PP逐漸增加，提示肝臟質(zhì)地變硬，剪切波傳播速度變快；而隨著HVAT、HV-HATT的增高，F(xiàn)PP呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)。

綜上所述，彈性成像ARFI技術(shù)、超聲造影技術(shù)參數(shù)與兔門靜脈壓力具有較好的相關(guān)性，是評(píng)價(jià)兔門脈高壓的潛在技術(shù)。