吳 震，朱文祥，劉洪茂，穆柯瀚，姬艷麗

近年來，關(guān)于高溫與男性生殖健康之間的關(guān)系日益受到生殖醫(yī)學領(lǐng)域的普遍關(guān)注。一些研究[1]已證實精子的發(fā)生、男性不育與陰囊溫度有關(guān)。課題組前期研究[2-3]也發(fā)現(xiàn)熱應激處理(43 ℃、15 min)后能夠明顯引起小鼠睪丸組織病理學損傷，誘導睪丸生殖細胞凋亡，但目前熱處理誘導睪丸生殖細胞凋亡的確切機制仍不清楚。

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是多種組織類型中廣泛分布的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的一個重要構(gòu)成部分。研究[4]表明，CaMKⅡ在激活狀態(tài)下與細胞凋亡有著密切聯(lián)系。現(xiàn)主要研究陰囊短暫、輕度熱應激對睪丸CaMKⅡ表達的影響，為進一步探討CaMKⅡ在急性熱應激誘導睪丸損傷中的作用及闡明熱應激對男性生殖損傷的機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級ICR小鼠(6～8周齡，♂，28～35 g)，購自安徽省實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)在實驗室溫度為20～25 ℃、濕度為(50±5)%、晝夜各12 h的動物房內(nèi)。實驗期間，小鼠自由攝食和飲水。實驗動物合格證號為SCXK(皖)2011-002。實驗研究符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》中的要求和規(guī)定。

1.2 化學試劑RT和PCR試劑盒購自美國Promega公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司；化學發(fā)光增強檢測試劑盒購自美國Pierce公司；β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自北京博奧森科技有限公司；磷酸化鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(phosphor-calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，p-CaMKⅡ)、ERK1/2、p-ERK1/2 抗體購自美國CST公司；其他生化試劑購自美國Sigma公司。

1.3 動物處理按照參考文獻[2]的處理方式，對小鼠進行熱應激處理。將24只成年ICR雄性小鼠隨機分為4組(每組6只，分別為對照組、熱應激0.5 h組、熱應激2 h組和熱應激6 h組)。將熱處理組小鼠身體下1/3部位置于43 ℃恒溫水浴中15 min，在熱處理后0.5、2、6 h后進行剖殺。將對照組小鼠身體下1/3部位置于22 ℃恒溫水浴中15 min，于6 h后剖殺取睪丸組織。采用Western blot技術(shù)分析各組睪丸p-CaMKⅡ、p-ERK1/2、 ERK1/2、β-actin蛋白表達水平。將對照組、熱應激2 h組和熱應激6 h組睪丸進行HE染色，采用免疫組織化學方法觀察p-CaMKⅡ 蛋白的表達水平。

1.4 睪丸組織切片取對照組、熱應激2 h組和熱應激6 h組一側(cè)完整包膜未破損的睪丸，置于4%MDF(含有30%甲醛、15%乙醇、5%冰乙酸和50%三蒸水)固定24 h，然后經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、HE染色、光學樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察睪丸組織病理學變化并拍照。

1.5 TUNEL每組選取睪丸石蠟切片各3張，按照參考文獻[3]進行TUNEL及酶標記反應，DAB顯色處理后采用蘇木素復染，于光鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.6Westernblot按照參考文獻[2]進行電泳、轉(zhuǎn)膜，采用5% 脫脂牛奶溫封閉后的PVDF膜分別用一抗[β-actin(1 ∶2 000)、p-CaMKⅡ(1 ∶2 000) 、ERK1/2(1 ∶5 000)、p-ERK1/2(1 ∶5 000)]4 ℃孵育過夜，之后用抗小鼠或抗兔IgG(β-actin：1 ∶40 000、p-CaMKⅡ：1 ∶40 000 、ERK1/2：1 ∶40 000、p-ERK1/2：1 ∶40 000)于搖床上室溫孵育1.5 h，采用化學發(fā)光試劑盒檢測各組蛋白的表達。Western blot結(jié)果分析：采用tanon4.2凝膠成像系統(tǒng)將目的蛋白的表達水平用內(nèi)參β-actin標化，將對照組標化后的比值定為1。

1.7 免疫組織化學檢測p-CaMKⅡ表達應用免疫組化PV-6000通用二步法檢測睪丸中p-CaMKⅡ的表達情況。檢測修復抗原、血清封閉后的睪丸病理切片采用一抗p-CaMKⅡ 4 ℃孵育過夜，之后采用相應二抗處理、DAB顯色、蘇木素復染。在顯微鏡下觀察p-CaMKⅡ的分布及表達情況。

2 結(jié)果

2.1 熱應激對睪丸組織病理的影響單次、短暫、輕度陰囊熱應激所誘導的睪丸損傷非常顯著，熱應激處理2 h后小鼠睪丸生殖細胞細胞核固縮，并在熱應激處理6 h后病理改變加重，表現(xiàn)為小鼠睪丸生精小管間隙增大，生精小管內(nèi)細胞排列紊亂，胞漿空泡化顯著,發(fā)生細胞核固縮的細胞增多(圖1B、1C)。陰囊熱應激能夠明顯誘導小鼠睪丸生殖細胞凋亡，其中主要表現(xiàn)為精原細胞和初級精母細胞的凋亡(圖2B、2C)。

2.2 熱應激對p-CaMKⅡ蛋白表達的影響采用免疫組化PV-6000通用二步法技術(shù)分析睪丸p-CaMKⅡ蛋白的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，熱應激后2 h、6 h組睪丸中p-CaMKⅡ(T286)蛋白的表達水平均顯著升高。Western blot研究結(jié)果表明，熱應激處理能夠明顯增加睪丸CaMKⅡ 蛋白的磷酸化(F=22.21,P<0.05)(圖3)，與免疫組化結(jié)果相一致(圖4)。

圖1 熱應激對睪丸病理的影響 HE染色×200A：對照組；B：熱應激2 h組；C：熱應激6 h組

圖2 熱應激對睪丸生殖細胞凋亡的影響 DAB染色×200A：對照組；B：熱應激2 h組；C：熱應激6 h組

圖3 熱應激對睪丸p-CaMKⅡ蛋白表達的影響

1：對照組；2：熱應激0.5 h組；3：熱應激2 h組4：熱應激6 h組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與熱應激2 h組比較：#P<0.05

圖4 熱應激對睪丸p-CaMKⅡ的分布表達的影響PV二步法×100

A：對照組；B：熱應激2 h組；C：熱應激6 h組

2.3 熱應激對p-ERK1/2蛋白表達的影響細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)存在于睪丸支持細胞及各級生精細胞中，對精子發(fā)生與成熟具有重要作用。本研究表明，熱應激能夠激活ERK，表現(xiàn)為熱應激組小鼠睪丸組織p-ERK1/2蛋白(Thr202/Tyr204)的表達水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(F=29.06,P<0.01)(圖5)。

3 討論

睪丸具有高度增殖能力，對溫度特別敏感，較高的陰囊溫度會損害精子發(fā)生。陰囊過熱引起的睪丸生殖細胞凋亡是男(雄)性不育的主要原因之一。研究證明，單次熱處理能引起睪丸組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[5-6]，熱應激主要通過線粒體信號通路誘導睪丸生殖細胞凋亡[7]，而CaMKⅡ蛋白在線粒體信號通路引起的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于CaMKⅡ蛋白在熱應激誘導的睪丸生殖細胞凋亡中是否發(fā)揮作用尚不清楚。

圖5 熱應激對睪丸p-ERK1/2蛋白表達的影響

1：對照組；2：熱應激0.5 h組；3：熱應激2 h組4：熱應激6 h組；與對照組比較：**P<0.01

CaMKⅡ具有四種亞型(α、β、δ和γ)，其中α亞基主要分布在前腦，與記憶功能有關(guān)[8]，β亞基具有維持突觸正常的結(jié)構(gòu)和功能的作用[9]，δ亞基主要存在于心臟中，與相關(guān)心臟疾病有關(guān)[10]。CaMKⅡ在睪丸中主要存在于早期精母細胞的生精小管最外層[11]。在靜息條件下，CaMKⅡ保持在非活性狀態(tài)，在應激狀態(tài)下，通過影響下游受體進而破壞細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)。一旦激活，CaMKⅡ即使在沒有Ca2+/CaM結(jié)合的情況下，也可通過蘇氨酸287的自磷酸化維持激活狀態(tài)[12]。

相關(guān)文獻[13]表明，抑制CaM和CaMKⅡ可降低線粒體信號通路相關(guān)凋亡蛋白的表達，提示CaMKⅡ可能通過線粒體通路引起細胞凋亡。此外，有研究[14]表明抑制CaMKⅡ能夠緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和氧化損傷，提高線粒體的完整性和膜電位。CaMKⅡ阻斷劑KN93、AIP均能夠減弱毒胡蘿卜素誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，同時還能夠抑制ERS誘導的細胞死亡，提示CaMKⅡ在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞死亡中具有重要作用[15]。本課題研究結(jié)果也表明，與對照組相比，熱應激處理能顯著誘導小鼠睪丸中p-CaMKⅡ蛋白的表達。提示p-CaMKⅡ在輕度熱應激引起的小鼠睪丸生殖細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。對小鼠進行熱應激處理后，可通過誘導小鼠睪丸中p-CaMKⅡ蛋白的表達，進而對小鼠睪丸組織造成病理損傷，造成小鼠睪丸生殖細胞凋亡的發(fā)生。對于陰囊溫度對雄性生殖健康影響的研究具有一定意義。

CaMKⅡ不僅是一個CaM效應器，而且能夠感知、整合和傳導細胞Ca2+和Ca2+-CaM信號。一些病理狀態(tài)下如腫瘤轉(zhuǎn)移、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和男性不孕，Ras-ERK信號通路被激活，同樣也能夠檢測到CaMKⅡ的改變，CaMKⅡ的過度表達可增強肌漿網(wǎng)Ca2+的釋放，也增強了線粒體Ca2+的攝取，從而導致細胞死亡。本研究也發(fā)現(xiàn)熱應激能顯著誘導小鼠睪丸中p-ERK1/2蛋白的表達，提示CaMKⅡ可能通過CaM-CaMKⅡ和ERK1/2信號通路導致線粒體的功能障礙，并進一步導致生殖細胞凋亡。