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      HDAC2與乙酰化P53k320在胃癌細胞中的表達及對其療效的評價

      2020-01-03 06:15:04
      關鍵詞:乙酰化免疫組化胃癌

      (臨沂市中心醫(yī)院,山東 沂水 276400)

      研究證實,腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多個信號通路和多基因共同參與的結果[1]。其中,細胞組蛋白乙?;艿浇M蛋白去乙?;?HDACs)和組蛋白乙?;D移酶的共同調控,當HDACs呈現為病理活性和異常表達后會引發(fā)機體免疫紊亂、肌營養(yǎng)不良以及癌癥的發(fā)生。有研究表明[2],HDAC2的目標蛋白為抑癌基因P53,其過度表達與惡性腫瘤發(fā)生相關,其表達的高低可作為臨床上獨立的預后指標,也可作為組蛋白去乙?;敢种苿?HDACi)療效的標志。本研究分析HDAC2、乙酰化P53k320在胃癌組織和癌旁組織細胞中的表達,探討其對療效的評價作用。

      1 資料與方法

      1.1臨床資料 選取2018年1月—2019年1月本院收治的胃癌患者130例,其中男86例,女44例;年齡35~75歲,平均(55.5±2.6)歲;腫瘤直徑:>5 cm者29例,≤5 cm者101例;Lauren分型:彌漫型35例,腸型82例,混合型13例;分化程度:高分化67例,中分化34例,低分化29例;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期68例,Ⅲ~Ⅳ期62例;淋巴結轉移:有59例,無71例。所有患者或家屬均簽署了知情同意書。所有患者經臨床治療后,完全緩解(CR)65例,部分緩解(PR)26例,穩(wěn)定(SD)19例,進展(PD)20例。

      1.2方法

      1.2.1組織采集 取所有患者手術切除的癌組織和癌旁組織,其中50%組織在10%中性甲醛中固定,24 h后行常規(guī)石蠟包埋,制作組織切片,厚度為4 μm,用于后續(xù)免疫組化染色。另外50%組織作后續(xù)細胞分離。

      1.2.2免疫組化 將所制備的癌組織和癌旁組織石蠟切片在二甲苯中重復脫蠟10 min,行梯度酒精水化,將蛋白酶修復液加入37℃的恒溫冰箱中行孵化處理30 min,去除抗原修復液,將所制備的切片轉移至內含3% H2O2的濕盒中,密封(去過氧化物酶封閉液),在37℃的恒溫冰箱中行孵化處理10 min,使用PBS清洗。清洗完成后將山羊血清加入,在室溫下封閉處理30 min,將封閉液吸除(濾紙),加入一抗,放入至適合后加入二抗,在室溫下孵育處理1 h,運用PBS清洗,行DAB顯色10 min,采用梯度乙醇進行脫水,采用二甲苯沖洗片3次直到透明,采用中性樹脂封片處理,顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。每份標本在鏡頭下隨機選擇5個視野,所有病理切片均由2位以上經驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法進行診斷。根據染色程度和染色細胞百分比進行評分:不著色0分,淡黃色1分,黃色2分,棕黃色3分;著色細胞數≤5% 0分,6%~25% 1分,26%~50% 2分,≥51% 3分。陰性(-)得分≤1分,弱陽性(+)得2~3分;中度陽性(++)得4~5分;強陽性(+++)得分≥6分。

      1.2.3細胞分離 取備用的癌組織和癌旁組織,去除結締組織后洗凈剪碎,使用0.1%的胰酶、0.025%的Ⅰ型膠原酶在37℃環(huán)境下消化30 min,使用濾網濾渣,在4℃環(huán)境下500×g離心5 min,棄去上清液;在DMEM-E培養(yǎng)基(5 ml,內含20%人血漿)中孵育5 min,細胞重懸后將20%的Percoll細胞分離液在4℃環(huán)境下500×g離心15 min,收集含有細胞的沉淀,經DMEM-E反復洗滌2次,每次均在4℃環(huán)境下500×g離心5 min,將所獲得的細胞轉移至培養(yǎng)瓶中,使用10% FBS、牛腦抽提物(100 g/ml)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/ml)的DMEM-E培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,棄去上清液,將未貼壁的細胞洗掉后繼續(xù)培養(yǎng),在培養(yǎng)1周后挑選多個形成的集落,混合均勻,轉移至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

      1.2.4癌細胞中HDAC2 mRNA檢測 采用熒光定量RT-PCR檢測,取對數生長期的胃癌細胞、癌旁細胞按照制備試劑盒說明書提取胎盤組織中總RNA,之后對RNA純度、含量進行檢測,使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA,之后使用Primer5.0軟件對引物序列進行設計,使用RT-PCR方法檢測胃癌細胞中HDAC2 mRNA表達量,采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的表達量。HDAC2引物序列:上游:5’-TGACATTGTGCTTGCTGTCC-3’,下游:5’-CCCTCAAGTCTCCTGTTCCA-3’;內參基因GAPDH引物序列:上游:5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’,下游:5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

      1.2.5癌細胞中HDAC2及乙?;疨53k320蛋白表達的檢測 取對數生長期的胃癌細胞、癌旁細胞,將培養(yǎng)液去除,反復使用PBS沖洗2遍,0.25%胰蛋白酶消化處理后離心,再次使用PBS反復沖洗2遍,將細胞收集至1.5 mL的離心管中,將200μL預冷的RIPA細胞裂解液在冰上采用超聲儀對細胞進行超聲裂解,2 s/次,共5次,在4℃環(huán)境下500×g離心5 min,將上清液轉移至新離心管中,蛋白定量分裝采用Bradford方法,采用Western blot法檢測胃癌細胞、癌旁細胞中HDAC2蛋白及乙?;疨53k320蛋白表達量。

      2 結果

      2.1HDAC2及乙?;疨53k320中陽性細胞的表達胃癌組織HDAC2陽性表達率高于癌旁組織,乙?;疨53k320陽性率低于癌旁組織。見表1、封二圖1。

      2.2HDAC2 mRNA HDAC2蛋白及乙?;疨53k320蛋白的表達 胃癌細胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白表達量均高于癌旁細胞,乙?;疨53k320蛋白表達量低于癌旁細胞。如表2、封二圖2。

      表1 兩種組織HDAC2及乙酰化P53k320中陽性表達情況比較[n(%)]

      表2 兩種細胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白及乙?;疨53k320蛋白表達情況

      2.3HDAC2及乙酰化P53k320對療效的評價作用 CR、PR、SD、PD組患者癌組織中HDAC2蛋白表達量呈增高趨勢,乙?;疨53k320蛋白表達量呈降低趨勢;兩兩比較顯示,各組之間均有統(tǒng)計學意義(q=5.75~54.76,P<0.05)。見表3、封二圖3。

      表3 HDAC2及乙?;疨53k320蛋白表達與療效的關系

      3 討論

      目前發(fā)現抑癌基因P53與人類腫瘤發(fā)生關系最為密切。臨床推測,胃癌的發(fā)生和進展可能與野生型P53功能受到抑制有關[3],這種抑制可能與表觀遺傳學組蛋白去乙酰化酶相關[4]。組蛋白乙?;D移酶具有催化乙?;淖饔?,使其轉移至組蛋白乙?;D移酶;而HDACs作用與其相反,可逆轉賴氨酸殘基乙酰化。可逆的乙?;瘯{控非組蛋白,包括P53、NF-κB、STATs等。因此,乙?;囊蕾囃放c其他轉錄后修飾具有一定的相關性,可維持機體動態(tài)平衡。正常P53需部分乙?;?,HDAC2是通過去乙?;{控P53。

      k320是位于P53DNA連接域/四聚化結構域,P53信號通路與k320乙?;嚓P。Brandl等[5]研究顯示,結腸癌細胞中HDAC2和P53之間的作用可抑制P53k320乙?;?,進而影響靶基因的轉錄調控。目前,隨著對HDAC2的研究深入,發(fā)現其在多數惡性腫瘤中均呈現高表達,包括卵巢癌、胰腺癌、腎癌、腎癌、肝癌等。Masoud等[6]研究發(fā)現HDAC抑制因子或者RNA抑制劑均會抑制腎癌細胞中HDAC2的高表達。在乳腺癌的研究中表明,抑制HDAC2表達會增強P53靶基因Bax的表達,細胞增殖加速[7-8]。有學者通過分析HDAC2與P53k320乙?;g的相關性[9-10],認為當P53k320乙酰化降低后會增加P53靶基因的表達,且HDAC2會逆轉P53k320乙?;?,促進細胞增殖。本研究結果顯示,胃癌細胞中HDAC2高表達,乙?;疨53k320低表達,表明在胃癌發(fā)生過程中,HDAC2表達升高可能抑制P53k320乙?;?。此外,本研究結果還顯示,患者治療效果越好者其HDAC2蛋白表達量越低,乙?;疨53k320蛋白表達量越高,這可能與胃癌患者治療后,HDAC2的高表達受抑制,P53k320乙?;黾?,最終促進癌細胞凋亡相關。提示,HDAC2、乙酰化P53k320可作為評估胃癌患者治療效果的指標。

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