創(chuàng)傷性閉合性中型顱腦損傷動物模型的建立

鐘旺旺 魏梁鋒 陳偉強(qiáng) 李田飛 張灝 王守森

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是由于外在機(jī)械力作用包括急性加速或減速運(yùn)動、爆震波、高處墜落、碰撞及槍彈貫穿等所引起的顱腦損傷。在發(fā)達(dá)國家中，TBI是造成青少年死亡、殘疾的首要因素[1]。隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展、公路交通暢通，TBI的發(fā)生率也逐年上升，其死亡率處于居高不下的態(tài)勢[2]。馬錦華等[3]對西安市多家醫(yī)院在2014年全年收治的2025例顱腦損傷住院患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)顱腦損傷類型以閉合性為主，占78.52%。因此本研究擬建立閉合性中等程度腦損傷動物模型，以期為后續(xù)的顱腦損傷研究提供動物模型。

材料與方法

一、實驗材料

實驗動物：健康雄性SD大鼠（SPF級）80只，體質(zhì)量320 g±20 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。試劑和儀器：兔單克隆抗體β-APP[Y188]和小鼠單克隆抗體NF-L[DA2]，均購自美國Abcam公司，參照Marmarou模型制作自由落體損傷裝置[4]。

二、實驗方法

1.動物分組：將80只健康雄性SD大鼠平均分為4組，將不同損傷程度的TBI小鼠分為A、B、C組以及假手術(shù)（N）組。各組動物實驗期間均飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院（原南京軍區(qū)福州總醫(yī)院）比較醫(yī)學(xué)科，并給予充足的飼料和飲用水。

2.動物模型：以10%的水合氯醛溶液（30 mg/100 g）腹腔注射麻醉后，暴露冠狀縫和人字縫之間的顱骨，用骨水泥使已消毒的墊片緊密貼于顱骨上方。參照Marmarou模型建立TBI模型，A、B、C組分別按擬定的打擊高度（1.0、1.5、2.0 m）使450 g的鋼棒自由下落撞擊大鼠頭部，撞擊后立即移開大鼠，避免二次打擊[4]。N組僅不作重物打擊，其他操作同TBI組大鼠。建模成功后用電熱毯維持大鼠肛溫于36.5℃±0.5℃。

3.觀察指標(biāo)：采用大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）評分量表對各組大鼠在傷后1、3和7 d進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)損害程度評估，監(jiān)測2周內(nèi)死亡率[5]。傷后1 d時各組隨機(jī)選取5只大鼠過量麻醉處死，行心腦灌注后完整取腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后制成蠟塊，用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察病理形態(tài)學(xué)改變、β-APP和NF-L表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。重復(fù)測量數(shù)據(jù)資料采用多組重復(fù)測量方差分析，組間均數(shù)比較采取方差分析進(jìn)行檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。計數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組大鼠TBI傷后一般狀況

TBI致傷組（A、B、C組）中，大鼠傷后均出現(xiàn)短暫意識喪失、呼吸抑制、心跳加速且伴四肢抽搐、足弓反張，接著呼吸淺快、心率減緩減慢至恢復(fù)平穩(wěn)，未能恢復(fù)自主呼吸的大鼠死亡。假手術(shù)組（N組）大鼠未出現(xiàn)上述癥狀。與假手術(shù)組比較，致傷組大鼠的意識恢復(fù)后，反應(yīng)遲鈍，主動活動減少；傷后14 d內(nèi)N、A、B、C組的死亡率分別為0%、5%、20%、60%，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A、B、C組大鼠顱骨骨折發(fā)生率依次為0%、5%、15%，各組間骨折率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

二、神經(jīng)行為學(xué)改變

B、C組大鼠傷后1、3及7 d的mNSS評分均高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組大鼠傷后1、3 d的mNSS評分明顯高于N組（P＜0.05），傷后7 d的mNSS評分與N組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與B組比較，A、C組mNSS評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳細(xì)信息見表1。

表1 各組大鼠傷后各時間點mNSS評分組間比較（）

表1 各組大鼠傷后各時間點mNSS評分組間比較（）

與N組比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

三、腦組織病理形態(tài)學(xué)檢查

HE染色結(jié)果（圖1）：N組，光鏡下神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元未見明顯的腫脹，血管周圍間隙無增寬。TBI傷后24 h時A、B、C組均可見不同程度基質(zhì)疏松，細(xì)胞周圍間隙和血管周間隙輕度擴(kuò)大，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫大，神經(jīng)元核固縮、胞體收縮呈三角形，胞質(zhì)嗜色性減弱，核皺縮濃染，細(xì)胞周圍間隙和血管周圍間隙較N組變寬。隨致傷量的增加，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、變性程度加重。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖2）：N組大腦皮質(zhì)、胼胝體區(qū)未見明顯β-APP、NF-L表達(dá)，其余各組均可見β-APP、NF-L在神經(jīng)元漿膜下和（或）軸突處積累，免疫組織化學(xué)染色呈棕染，隨致傷量的增加，其陽性染色體神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)增加和表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)。損傷后24 h，A、B、C組大腦皮質(zhì)β-APP和NF-L表達(dá)程度逐漸增強(qiáng)。

討論

TBI因其高發(fā)生率、致殘率及致死率，社會醫(yī)療成本高，一直以來都是全球重點關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題之一。通過建立動物模型認(rèn)識和了解TBI發(fā)生機(jī)制、病理生理演變過程，可以更好地提高醫(yī)務(wù)工作者對TBI的研究水平，進(jìn)而推動社會和醫(yī)學(xué)的發(fā)展。目前研究較為廣泛的TBI模型有液體沖擊損傷模型、可控皮質(zhì)撞擊損傷模型、減速或加速撞擊損傷模型、爆炸性損傷模型和瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型等[4,6-10]。本文以Marmarou模型為基礎(chǔ)，建立3組不同損傷程度的TBI，進(jìn)而分析出中型TBI所需致傷量。

現(xiàn)已證實Marmarmou模型建立的TBI動物模型主要以彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury,DAI）為主，其病理特征在于腦組織受剪切力作用后軸索斷裂損傷，軸索斷端可呈圓柱狀擴(kuò)大和出現(xiàn)典型回縮球等變化。實驗中大鼠TBI后HE染色可見大腦皮質(zhì)不同程度基質(zhì)疏松，細(xì)胞周圍間隙和血管周間隙輕度擴(kuò)大，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫大，神經(jīng)元核固縮、胞體收縮呈三角形，胞質(zhì)嗜色性減弱，核皺縮濃染，細(xì)胞周圍間隙和血管周圍間隙較假手術(shù)組變寬，即神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂、變性程度隨致傷量的增加而加重。HE染色未能明確顯示出軸索斷裂、損傷的形態(tài)，而β-APP染色可顯示典型的軸索收縮球。β-APP是一種具有膜受體蛋白樣的單跨膜蛋白，廣泛存在于全身組織中，在正常狀態(tài)下表達(dá)水平很低，可不被檢出；而NF-L是構(gòu)成NF的三個亞單位之一，分布于神經(jīng)元的胞體和突起內(nèi)，呈低磷酸化狀態(tài)，傷后快速發(fā)生磷酸化、降解；TBI時，細(xì)胞骨架破壞、軸索斷裂引起軸漿運(yùn)輸障礙，β-APP、NF-L異常聚集于軸索斷端、陽性表達(dá)上調(diào)而被檢出[11,12]。研究表明β-APP和NF-L在TBI后的表達(dá)程度與損傷程度呈正相關(guān)，即損傷程度越重，陽性表達(dá)越明顯，而且表達(dá)水平在傷后早期即開始升高[13]。此外，其他研究同樣發(fā)現(xiàn)β-APP、NF-L的表達(dá)程度與DAI損傷程度相關(guān)，而且具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，可作為DAI早期診斷標(biāo)志物[14-16]。在法醫(yī)鑒定過程中，顱腦標(biāo)本β-APP、NF-L的表達(dá)與否、表達(dá)程度亦可幫助推斷腦損傷發(fā)生時間及死亡時間[17]。本研究中TBI組中大鼠腦組織均可見病理形態(tài)學(xué)改變和β-APP、NF-L表達(dá)，且隨著致傷量的增加，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變加重，β-APP、NF-L陽性表達(dá)水平增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報道基本一致。

圖2 各組大鼠建模24 h后腦組織損傷區(qū)免疫組織化學(xué)染色（×400）

在TBI動物模型建立和應(yīng)用研究中，尚缺乏統(tǒng)一的、與臨床TBI患者GCS評分或GOS評分類似的量化評分系統(tǒng)，以評估動物TBI傷后損傷程度及預(yù)后評估，部分學(xué)者通過結(jié)合傷后大鼠血清中腦損傷標(biāo)志物來評估腦損傷程度[18,19]。本研究通過分析比較各組大鼠傷后一般狀況、神經(jīng)行為學(xué)改變和腦組織病理改變推斷出輕型、中型、重型TBI所對應(yīng)致傷量，均可滿足對腦損傷程度的評估。結(jié)果顯示，在3種不同致傷量作用下，大鼠在一般狀況、神經(jīng)行為學(xué)改變和腦組織病理改變均有異常表現(xiàn)，且隨著致傷量的增加，各觀察指標(biāo)損傷程度加重。在相同損傷程度組內(nèi)，各組大鼠觀察指標(biāo)基本保持一致，具有較高的可重復(fù)性。A組傷后各時間點mNSS評分較低，恢復(fù)較快，腦組織病理改變程度較輕，DAI分子標(biāo)志物（β-APP和NF-L）輕度表達(dá)；而B和C組傷后損傷程度相對較重，mNSS、腦組織形態(tài)學(xué)改變、β-APP和NF-L陽性表達(dá)程度等更加嚴(yán)重或明顯；其中，B與C組間mNSS評分比較差異顯著。此外，A組未出現(xiàn)死亡或骨折情況，而C組死亡率為60%，骨折發(fā)生率為15%，與文獻(xiàn)中重型TBI動物損傷情況報道基本相符[4,20]。因此，A組定義為輕型TBI，因C組較B組更符合重型TBI，B組有一定的死亡率和骨折發(fā)生率，且介于輕型、重型TBI組之間，故而將B組定義為中型TBI更為準(zhǔn)確。

綜上所述，本研究通過選定合適的致傷量，控制大鼠死亡率、神經(jīng)行為學(xué)缺損嚴(yán)重度、腦組織形態(tài)學(xué)改變程度，獲得了滿意的中型TBI動物模型，其可用于海上TBI損傷模型機(jī)制及其傷后病理生理變化的動態(tài)研究等，具有較重要的參考價值和意義。