促進(jìn)再生牙髓血管化的支架研究進(jìn)展

劉慧敏，李祥偉

吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，吉林 長(zhǎng)春（130021）

牙髓再生是牙體牙髓領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，再生牙髓血運(yùn)重建是牙髓再生的瓶頸，而所應(yīng)用的支架材料又是血運(yùn)重建的關(guān)鍵。本文對(duì)促進(jìn)再生牙髓血運(yùn)重建所應(yīng)用支架材料的種類、優(yōu)點(diǎn)及不足等進(jìn)行綜述，為牙髓再生篩選適合根管解剖特點(diǎn)、容易獲取和應(yīng)用、生物相容性良好且生物降解率與組織的生成相協(xié)調(diào)的促進(jìn)牙髓組織血運(yùn)重建的支架提供依據(jù)。

1 牙髓組織血液供應(yīng)的特點(diǎn)

牙齒由硬組織（釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)）和具有高度血管化并有神經(jīng)支配的疏松的結(jié)締軟組織（牙髓）組成。牙髓是一種具有高度再生能力的充分血管化的結(jié)締組織，這得益于其獨(dú)特的血液供應(yīng)及祖細(xì)胞或未分化間充質(zhì)細(xì)胞的存在［1］。血管與豐富的感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)一起通過(guò)根尖孔進(jìn)入髓腔，在成牙本質(zhì)細(xì)胞層下形成致密的毛細(xì)血管網(wǎng)和神經(jīng)叢，以滿足臨近成牙本質(zhì)細(xì)胞層和多細(xì)胞層內(nèi)細(xì)胞的功能需求［2］，這有益于維持牙髓的穩(wěn)態(tài)。

牙髓與牙本質(zhì)在胚胎發(fā)生上聯(lián)系很密切，對(duì)外界刺激的應(yīng)答具有互聯(lián)的效應(yīng)，是一個(gè)整體，被稱為牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體能夠修復(fù)因齲、磨耗和窩洞預(yù)備等引起的牙體組織損傷，表現(xiàn)為第三期牙本質(zhì)的形成，即當(dāng)發(fā)生低度炎癥時(shí)，成牙本質(zhì)細(xì)胞通過(guò)血管新生和牙本質(zhì)生成途徑促進(jìn)再生機(jī)制，提高牙髓防御能力，形成反應(yīng)性牙本質(zhì)［3］。如果成牙本質(zhì)細(xì)胞死亡，牙髓間充質(zhì)細(xì)胞取代它們分化為成牙細(xì)胞樣細(xì)胞，形成修復(fù)性牙本質(zhì)，這些過(guò)程均需要牙髓充分的血液供應(yīng)作為必要前提［4］。因此，牙髓良好的血液供應(yīng)是牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。

在牙髓再生中，血管生成是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體發(fā)育和再生的基礎(chǔ)，通過(guò)狹窄的根尖孔尺度建立充分、有效的血液循環(huán)是研究者面臨的巨大挑戰(zhàn)之一［5］。

2 牙髓再生中促進(jìn)血管化的支架材料和結(jié)構(gòu)

在再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的功能材料應(yīng)具有良好的生物相容性和生物學(xué)活性，以便為種子細(xì)胞附著和在生長(zhǎng)因子作用下的細(xì)胞分化營(yíng)造適宜的微環(huán)境。由于根管解剖條件的限制和根管環(huán)境的特殊性，牙髓組織再生中所應(yīng)用的支架在組織再生中具有關(guān)鍵作用，支架材料應(yīng)當(dāng)可生物降解，允許細(xì)胞附著其表面，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，并且能夠承受一定的機(jī)械壓力，同時(shí)植入物也應(yīng)該能方便地植入根管內(nèi)，并能夠避免植入物發(fā)生松動(dòng)和其他不良反應(yīng)［6］。根據(jù)支架材料的來(lái)源不同，主要有天然、人工合成和復(fù)合材料等。

2.1 應(yīng)用于血管再生的天然支架材料

2.1.1 殼聚糖 殼聚糖（chitosan，CS）是天然高分子化合物，是甲殼素脫乙?；难苌?，是世界上僅次于纖維素的第二大類多糖材料［7］。甲殼素因溶解性能差而應(yīng)用受限，殼聚糖的水溶性依賴于pH值，允許在溫和的條件下加工，這使該材料具有廣闊的應(yīng)用前景［8］。殼聚糖具有可生物降解性和生物相容性，無(wú)毒且具有抗菌和黏附性能［7］，是組織支架所必需的一種獨(dú)特性能的聚合物，且其降解的產(chǎn)物是一種無(wú)毒的低聚糖，可以被排除或結(jié)合到糖胺聚糖或糖蛋白中［9］。殼聚糖是唯一一種帶有正電荷的多糖，正電荷數(shù)量增加，細(xì)胞與殼聚糖相互作用增加，生物相容性也會(huì)改善［8］。由于殼聚糖與細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)類似，故用于血管工程的研究［10］。

2.1.2 透明質(zhì)酸 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種天然的普遍存在于身體各部位的糖胺聚糖，在天然組織中控制著細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)［11］。HA在正常組織中起許多作用，包括炎癥發(fā)生、血管生成、腫瘤發(fā)生、水穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的粘彈性改變，HA的理化性質(zhì)（如溶解性）及活性官能團(tuán)有助于對(duì)HA進(jìn)行化學(xué)修飾，使其成為適用于組織再生的生物相容材料［12］。HA具有非免疫原性、非抗原性、生物相容性與生物學(xué)活性［13］。與其他聚合物相比，它具有較強(qiáng)的保水能力，吸水量達(dá)到自身體積的千倍［7］。有研究證明，透明質(zhì)酸在其保水能力、為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)及清除細(xì)胞中的廢物等重要生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用［7］。在血管發(fā)育中，透明質(zhì)酸通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移發(fā)揮重要作用。有研究表明，使用HA水凝膠來(lái)監(jiān)測(cè)新生血管網(wǎng)形成所需的細(xì)胞重塑，HA水凝膠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞集落形成液泡和管腔，以及血管的分支和發(fā)芽，逐步形成血管網(wǎng)絡(luò)［14］。HA支架也具有一些局限性，如引起異物反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等，造成HA支架表面物理和化學(xué)性質(zhì)的變化，其中，非特異性蛋白吸附可能是引起異物反應(yīng)的主要原因；同時(shí)HA或HA降解產(chǎn)物的異常積聚可對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)產(chǎn)生負(fù)面影響［12］。

2.1.3 細(xì)菌纖維素 細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種由細(xì)菌產(chǎn)生的新型生物相容性納米材料［15］，比植物纖維素具有更優(yōu)良的理化特性，具有結(jié)晶度、純度高、黏附性好、可塑性好和保水能力強(qiáng)以及生物親和性優(yōu)異等特點(diǎn)［16］。由于人體中沒有可以分解細(xì)菌纖維素的酶或強(qiáng)酸微環(huán)境，故不需要擔(dān)心細(xì)菌纖維素的降解以及其它化學(xué)衍生聚合物形成的問(wèn)題。其優(yōu)異的性能使細(xì)菌纖維素成為一種制備人造血管的組織工程材料。細(xì)菌纖維素管具有精細(xì)的納米纖維結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的機(jī)械性能和高熱穩(wěn)定性，對(duì)體內(nèi)環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，故在組織工程領(lǐng)域細(xì)菌纖維素管作為血管管狀支架材料具有廣闊的應(yīng)用前景［17］。細(xì)菌纖維素管具有很好的手術(shù)實(shí)用性，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法消毒，在大鼠、豬和綿羊等動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，細(xì)菌纖維素管成功地替代了其頸動(dòng)脈［16］。在具有內(nèi)徑＜8 mm的有機(jī)硅管中培養(yǎng)細(xì)菌纖維素，獲得了所需長(zhǎng)度、內(nèi)徑、厚度和單軸取向纖維的管狀細(xì)菌纖維素凝膠，其具有優(yōu)異的機(jī)械性能，在醫(yī)學(xué)和藥物應(yīng)用中有望用作微血管或軟組織材料［18］。

2.1.4 原花青素 原花青素（Proanthocyanidins，PACs）是植物源的多功能化合物，與細(xì)胞外基質(zhì)成分具有高度的相互作用。PAC二聚體、三聚體和四聚體不僅具有生物相容性，而且還增強(qiáng)了牙髓細(xì)胞向有利于生物礦化的表型分化；富含PACs的精制混合物可以作為可再生的、非細(xì)胞毒性的藥劑，增加生物材料的機(jī)械性能，作為生物材料而應(yīng)用于再生領(lǐng)域；低聚PACs不僅能與牙髓細(xì)胞生物相容，而且還能促進(jìn)該細(xì)胞群的增殖，這一點(diǎn)可以通過(guò)分化、牙本質(zhì)生成和生物礦化的關(guān)鍵基因的上調(diào)來(lái)體現(xiàn)；這些對(duì)于評(píng)價(jià)低聚PACs作為有效的組織修復(fù)和再生生物材料具有重要意義［19］。

2.2 應(yīng)用于血管再生的合成支架材料

2.2.1 水凝膠 水凝膠（hydrogel）作為藥物傳遞系統(tǒng)或細(xì)胞三維培養(yǎng)支架廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，水凝膠被定義為由親水性大分子組成的三維系統(tǒng)，其交聯(lián)可導(dǎo)致水合聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成［11］，它們具有高度的生物相容性、高含水量、多種可調(diào)特性、細(xì)胞相容性及細(xì)胞黏附位點(diǎn)，是支持細(xì)胞命運(yùn)的三維微環(huán)境［20］。凝膠化與生物降解是影響細(xì)胞的關(guān)鍵因素［21］。

HA和α彈性蛋白的共聚物——HA-EDA-g-αelastin/HA水凝膠對(duì)于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和增殖是最佳基質(zhì)，該凝膠能吸收大量的水介質(zhì)，抓住血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子并控制其釋放，釋放的生長(zhǎng)因子可以刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和遷移［11］。同時(shí)水凝膠在體內(nèi)有可能降解，HAase酶促降解產(chǎn)物（HA片段），小片段的HA可通過(guò)CD44和RHAAM受體介導(dǎo)的一系列事件與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用［11］，和/或通過(guò)誘導(dǎo)粘著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路刺激內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖和遷移，以及促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新血管的生成［12］。水凝膠通常表現(xiàn)出與軟組織類似的非線性應(yīng)力應(yīng)變反應(yīng)以及存在固有的強(qiáng)度和剛度的限制，這妨礙了它們?cè)谀承?yīng)用中的適用性［22］。

殼聚糖/明膠復(fù)合物具有與糖胺聚糖和膠原蛋白相似的結(jié)構(gòu)，可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的天然成分，從而為細(xì)胞存活提供了合適的環(huán)境，凝膠形成機(jī)制有很多，其中對(duì)于治療有利的是溫敏方法。脂肪干細(xì)胞分泌多種血管生成生長(zhǎng)因子，在利用脂肪干細(xì)胞治療缺血性疾病的研究中，殼聚糖/明膠溫敏水凝膠不僅為維持脂肪干細(xì)胞的存活提供合適的微環(huán)境，而且能夠使脂肪干細(xì)胞持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子促進(jìn)組織血管的形成，從而在治療缺血性疾病中顯示出巨大的臨床潛力［23］。溫敏水凝膠形態(tài)可控，可便于將支架材料導(dǎo)入根管，制備出適合根管形態(tài)的支架，這推動(dòng)了牙髓再生的研究。有研究者利用纖維素納米晶體以及富含血小板的裂解液進(jìn)行對(duì)注射用HA水凝膠進(jìn)行改進(jìn)以增強(qiáng)趨化性和促血管生成活性，促進(jìn)血管化損傷組織的再生；改進(jìn)后的可注射用HA水凝膠在體外模型及離體模型實(shí)驗(yàn)中，可以招募牙源性干細(xì)胞和促進(jìn)新血管樣結(jié)構(gòu)的形成［24］。也有研究者將載VEGF的膠原凝膠液注入空根管模型中，異位移植于裸鼠皮下，3周后組織學(xué)觀察可見血管化組織的形成［25］。

2.2.2 冷凍凝膠 冷凍凝膠（cryogel）是克服水凝膠在使用上的一些限制而尋找新的材料；冷凍凝膠是指在零度以下從可聚合前體的冷凍溶液中得到的凝膠基質(zhì)。冷凍凝膠的形成可描述為：冰晶體相分離，交聯(lián)和通過(guò)冰晶體的溶解形成相互連接的多孔網(wǎng)絡(luò)。以戊二醛為交聯(lián)劑，以殼聚糖和HA為原料，采用冷凍凝膠技術(shù)制備了天然冷凍凝膠支架，聚合物冷凍凝膠具有90%～95%的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙度150～200μm；表現(xiàn)出可生物降解的性質(zhì)和迅速膨脹的行為；通過(guò)HA的共聚和共聚，提高了膨脹比、柔性和耐久性。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，這些冷凍凝膠適合于3T3成纖維細(xì)胞和SAOS-2細(xì)胞的發(fā)育；MTT法檢測(cè)顯示，HA促進(jìn)3T3成纖維細(xì)胞和SAOS-2細(xì)胞的增殖；同時(shí)高孔隙率的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有助于3T3成纖維細(xì)胞和SAOS-2細(xì)胞的粘附和擴(kuò)散；殼聚糖-HA冷凍凝膠支架的經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究后，有望應(yīng)用于組織工程［7］。

另有研究者采用凍干法制備了以殼聚糖、膠原蛋白、HA為主，輔以納米羥基磷灰石的支架材料。細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，在富含羥基磷灰石的情況下，支架表面的細(xì)胞附著和生長(zhǎng)得到改善，而體內(nèi)植入兔皮下組織植入6個(gè)月后，該支架對(duì)周圍組織無(wú)刺激和炎癥等反應(yīng)［6］。

2.2.3 靜電紡絲 靜電紡絲（electrospinning，ESP）技術(shù)可以產(chǎn)生與各種組織細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維形態(tài)相似的纖維結(jié)構(gòu)，也可以控制纖維的排列；同時(shí)，大多數(shù)的靜電紡絲都是平的或管狀結(jié)構(gòu)，由厚度有限的密集排列的纖維組成，具有很好的強(qiáng)度，但不表現(xiàn)出血管組織的非線性“J形”應(yīng)力-應(yīng)變效應(yīng)；血管移植物和組織工程血管的依從性使其在體內(nèi)長(zhǎng)期具有功能；以水凝膠和電紡纖維結(jié)合制備的血管支架材料，具有自然血管在平均壓力范圍內(nèi)的順應(yīng)性特征［22］。通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備的殼聚糖纖維具有較好的生物相容性，有助于細(xì)胞黏附、保持細(xì)胞形態(tài)和活力［8］。

2.2.4 微球 Garzon等［26］檢測(cè)了兩種不同表面（納米纖維或光滑表面）的具有生物活性的可注射用聚-A-乳酸微球的生物相容、生物安全性以及根管內(nèi)牙髓再生的能力。Li等［27］合成了載VEGF的L-聚乳酸-肝素-明膠納米纖維微球，并將其作為支架材料，牙髓干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，進(jìn)行牙根異位移植牙髓全長(zhǎng)再生的研究中，在長(zhǎng)為11 mm的空牙根根管模型中，可見有9 mm的牙髓樣組織的形成。

2.3 應(yīng)用于牙髓再生的仿生復(fù)合支架系統(tǒng)

有研究者將自體血管細(xì)胞與可生物降解管狀支架結(jié)合，創(chuàng)造出一種血管替代物，植入自體血管細(xì)胞的雙層血管支架可以產(chǎn)生完全細(xì)胞化的血管結(jié)構(gòu)，可以替代小直徑血管，帶細(xì)胞的血管結(jié)構(gòu)保持了高度的移植物通透性、結(jié)構(gòu)完整性和順應(yīng)性以及收縮性，血管支架具有生物降解性和生物穩(wěn)定性，羊動(dòng)脈模型實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)月內(nèi)不會(huì)引起異物反應(yīng)，其長(zhǎng)期療效還需進(jìn)一步觀察［28］。自體血管細(xì)胞的應(yīng)用減少了免疫排斥反應(yīng)，具有較好的生物相容性。一種具有雙層管狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖-明膠大孔水凝膠骨架也有助于血管支架的研究發(fā)展，外層模擬血管三維基質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，同時(shí)具有良好的抗拉強(qiáng)度、生物相容性和可生物降解性，該類支架有望成為血管組織工程很好的管狀原型［29］。