李 琳，羅淋淋,3，羅光宇,3，莫蓓莘，劉 琳

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；2)深圳大學(xué)龍華生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，廣東深圳518060；3)深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，廣東深圳518060

植物基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，然而植物基因型鑒定等需要大樣本量基因組DNA的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，往往需要耗費(fèi)大量時(shí)間和精力進(jìn)行DNA提取.傳統(tǒng)的DNA提取方式，如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)法[1-2]、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)法[3]和提取試劑盒等都存在步驟繁瑣、耗時(shí)過長和試劑有毒有害等問題，且在提取過程中還會(huì)產(chǎn)生大量廢液，不能滿足大批量實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的要求.現(xiàn)已報(bào)道了多種優(yōu)化的快速基因組提取方法，常規(guī)做法是更換個(gè)別試劑或簡化特定步驟[4-5]，但對大規(guī)模實(shí)驗(yàn)來說，這些方法仍較繁瑣，且適用面較窄，主要用于水稻[6-7]和擬南芥[8]等少數(shù)模式植物.為此，本研究借鑒已有的快速提取植物基因組DNA的方法[9-14],經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)和對體系不斷的調(diào)整優(yōu)化，最終確立了一套適用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)鑒定的植物基因組DNA快速提取方法.該方法只需將少量植物葉片(以水稻為例，取樣量僅為3 mm×5 mm～3 mm×10 mm)放入96孔板中，加入120～150 μL提取液和2～3粒直徑為2 mm的氧化鋯珠，在高通量組織研磨儀上震蕩破碎1～2 min后得到植物提取液，即可直接應(yīng)用于PCR反應(yīng).本方法成本低、PCR產(chǎn)物擴(kuò)增效率高，且結(jié)果穩(wěn)定，適于多種處于不同時(shí)期和狀態(tài)的植物基因組DNA的提取，尤其適于大樣本量的實(shí)驗(yàn)并能顯著縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以水稻(OryzasativaL.)日本晴、玉米(ZeamaysL.)B73、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)Columbia生態(tài)型、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)成熟期的葉片為實(shí)驗(yàn)材料.同時(shí)，將水稻和擬南芥的地上及地下部分分別取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 提取緩沖液的配置

CTAB法提取緩沖液配方及提取方法見文獻(xiàn)[14].本實(shí)驗(yàn)所使用DNA 10×提取緩沖液母液按100 mmol/L Tris (pH=9.5)、5 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylened diaminetetraacetic acid, EDTA)、5 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl配方配置，使用時(shí)使用去離子水稀釋至1×即可.該濃縮型提取液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱可保存6～10個(gè)月.

1.3 植物基因組DNA的提取和檢測

用剪刀剪取3 mm×5 mm～3 mm×10 mm的植物葉片，置于已加入2～3顆直徑為2 mm的氧化鋯珠和120～150 μL提取緩沖液的96孔板中.將葉片壓于管底，勿緊貼管壁.蓋好配套硅膠蓋后上下?lián)u晃檢查密封性，在高通量組織研磨儀(上海凈信 Tissuelyser-192)上以60 Hz頻率震蕩破碎10～120 s(葉片越新鮮幼嫩振蕩時(shí)間越短)，再以4 000 r/min速率低速離心60 s(離心目的是沉淀雜質(zhì)，該步驟也可省略)，緩慢揭去硅膠蓋，清理96孔板表面防止樣品交叉污染，所得上清可直接用于PCR擴(kuò)增或于-20 ℃儲(chǔ)存.如樣本數(shù)目較少，可選擇0.2 mL八聯(lián)排PCR管或1.5/2.0 mL的離心管作為提取容器，但需根據(jù)要求調(diào)整研磨條件，研磨時(shí)間過久可能擊碎離心管壁，導(dǎo)致樣品流失.

得到植物基因組DNA后，使用Invitrogen Qubit 3.0熒光定量儀和Qubit dsDNA HS Assay 試劑盒(Q32854)對DNA濃度進(jìn)行測定，檢測方法參照說明書.同時(shí)，本研究從DNA的保存時(shí)間、植物組織部位和DNA完整度方面檢測了該提取體系的適用性，并對結(jié)果的可靠性進(jìn)行評測.

1.4 PCR反應(yīng)體系和條件

在實(shí)驗(yàn)操作過程中，PCR反應(yīng)體系可根據(jù)物種和實(shí)驗(yàn)用途進(jìn)行稍作調(diào)整.一般情況下，擴(kuò)增所用的模板量為0.5～1.0 μL，可根據(jù)不同植物類型及實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.本實(shí)驗(yàn)使用的Taq酶為Vazyme 2×Taq master mix，擴(kuò)增體系為：10× PCR buffer: 2 μL；引物(10 nmol/L): 0.8～1.0 μL；dNTP (10 mmol/L): 0.5～1.0 μL；DNA提取液: 0.5～1.0 μL；Taq酶: 0.3～0.5 μL；雙蒸水補(bǔ)足至20 μL.PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35～38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.對于擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)無特殊要求，遵循正常擴(kuò)增反應(yīng)的設(shè)計(jì)規(guī)則即可.由于使用該方法提取的植物基因組DNA濃度較低，建議擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為35個(gè)以上，以保證獲得足量的產(chǎn)物.

1.5 SNP和SSR檢測

以水稻為例，通過RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn/v1/contact/)查找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物對多個(gè)水稻品種進(jìn)行PCR鑒定和測序；通過Gramene(http://archive.gramene.org/markers/microsat/50_ssr.html)提供的水稻簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat, SSR)標(biāo)準(zhǔn)引物序列，隨機(jī)挑選引物對多個(gè)水稻品種進(jìn)行PCR鑒定和瓊脂糖凝膠電泳檢測.所檢測的水稻品種信息見表1，引物設(shè)計(jì)和對應(yīng)基因信息見表2.

表1 SNP和SSR檢測所用水稻品種信息表

表2 檢測引物表

(續(xù)表2)

1.6 引物信息

表2列出了實(shí)驗(yàn)所用的引物.其中，編號1～4的引物用于檢測不同物種中利用快速提取方法得到的基因組DNA保存時(shí)間的實(shí)驗(yàn)；編號3～4的引物同時(shí)也用于檢測在擬南芥和水稻中快速提取法所得基因組為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序質(zhì)量和對植物不同組織的適用性實(shí)驗(yàn)；編號5～16的引物用于檢測快速提取法所得植物基因組DNA的完整性實(shí)驗(yàn)；編號17～21的引物用于檢測快速提取法對SNP和SSR分析適用性實(shí)驗(yàn).

2 結(jié) 果

2.1 快速提取法獲得的DNA質(zhì)量滿足PCR擴(kuò)增及測序鑒定的要求

用本研究提取法對水稻、擬南芥、玉米和馬鈴薯進(jìn)行測試.由于采用微量提取方法，樣品的取樣量少，所得基因組DNA濃度低，難以被瓊脂糖凝膠電泳檢測到.通過Qubit熒光定量儀可對提取所得基因組DNA進(jìn)行定量，測定濃度為3～4 ng/μL(150 μL體系)，總質(zhì)量為450～600 ng.

該快速提取方法對PCR體系無特殊要求，采用常規(guī)體系即可.由于植物基因組DNA快速提取法是粗提DNA，未經(jīng)純化，為保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定且可重復(fù)，PCR添加模板量不宜太多.20 μL體系中，不同物種PCR反應(yīng)模板量建議請掃描論文末頁右下角二維碼查看表S1.

擬南芥和水稻樣品利用本研究方法和CTAB法所提取DNA為模板的PCR擴(kuò)增測序結(jié)果請掃描論文末頁右下角二維碼見圖S1.4個(gè)物種利用兩種提取法所做的PCR擴(kuò)增結(jié)果無明顯區(qū)別，所得測序峰圖都尖銳且單一，表明兩種提取法所得基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序質(zhì)量相似.利用該方法所得的基因組DNA質(zhì)量完全滿足測序鑒定等分子實(shí)驗(yàn)的要求，可進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究.

2.2 快速提取法獲得的DNA可長時(shí)間保存

以擬南芥、水稻、玉米和馬鈴薯為材料，利用快速提取法獲得基因組DNA，對提取當(dāng)天的樣品和-20 ℃下保存了7、30、60和120 d的樣品，分別進(jìn)行PCR檢測，并設(shè)置CTAB法提取的DNA作為對照，結(jié)果如圖1所示.其中，bp為堿基對(base pair).從圖1可見，所有樣品都有清晰整齊的條帶，表明該方法所得基因組DNA可在-20 ℃下完整保存至少4個(gè)月，能夠滿足一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需要.

圖1 利用植物基因組DNA快速提取法獲得的植物基因組DNA在不同保存時(shí)間下的PCR檢測

2.3 快速提取法的適用性

2.3.1 快速提取法適用于植物不同組織和不同生長狀態(tài)的葉片

為檢測該基因組提取方法對植物不同組織和生長狀態(tài)的適用性，本研究以擬南芥和水稻不同組織和不同狀態(tài)的葉片為材料，提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，結(jié)果如圖2.本研究選取了葉片狀態(tài)相對較差的老葉、黃葉及根部作為實(shí)驗(yàn)材料，對樣品研磨后進(jìn)行PCR檢測.結(jié)果顯示，所有樣本皆能成功提取到基因組DNA，且檢測條帶明亮、單一，表明該方法適用于植物不同組織和生長狀態(tài)基因組DNA的提取鑒定.

2.3.2 快速提取法獲得的基因組DNA完整性高

使用本研究方法獲得的PCR產(chǎn)物片段都少于1 000 bp，為驗(yàn)證所提取基因組DNA的完整性，以擬南芥和水稻為例，通過擴(kuò)增不同長度的DNA片段進(jìn)行驗(yàn)證，如圖3.分別選取擬南芥和水稻多個(gè)不同基因，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增100(p1)、450(p2)、750(p3)、1 000(p4)、2 000(p5)和4 000 bp(p6)基因片段，PCR檢測結(jié)果顯示所有條帶清晰單一穩(wěn)定，表明利用本研究方法所提取的基因組DNA具有較高完整性，適用于各種長度片段的常規(guī)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn).

圖2 植物基因組DNA快速提取法對水稻、擬南芥不同狀態(tài)葉片和不同組織部位的適用性檢測

圖3 植物基因組DNA快速提取法所得植物基因組DNA完整性檢測

2.3.3 快速提取法適用于SNP和SSR分析

為進(jìn)一步檢測該快速提取方法得到的基因組DNA是否適用于SNP和SSR分析，本研究針對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的多個(gè)水稻品種設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(水稻品種和引物相關(guān)信息見表1和表2).

選取8個(gè)水稻品種進(jìn)行檢測，圖4(a)和圖4(b)分別展示了使用快速提取法和CTAB法得到的粳稻CAU2和秈稻金南特B兩個(gè)品種基因組DNA對ARF2和PHYC基因的PCR擴(kuò)增測序結(jié)果，限于篇幅，其他6個(gè)水稻品種的SNP測序結(jié)果請掃描論文末頁右下角二維碼見圖S2.其中，序列上方數(shù)字為此段序列在基因中的位置.結(jié)果顯示，檢測的不同水稻品種在該基因中的單核苷酸突變與在RiceVarMap提供的基因突變位點(diǎn)相同，用CTAB法提取的植物基因組DNA和快速提取方法得到的測序結(jié)果無差異.針對SSR分析實(shí)驗(yàn)，參考Gramene網(wǎng)站(http://archive.gramene.org/markers/microsat/50_ssr.html)提供的水稻SSR標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)引物序列，隨機(jī)挑選3對引物對8個(gè)水稻品種進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖5.瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，不同品種之間的SSR序列是有區(qū)別的，且用CTAB法提取的植物基因組DNA和本研究提出的快速提取方法得到的結(jié)果無差異，表明該植物基因組DNA快速提取法穩(wěn)定可靠，適用于SNP和SSR的分析檢測.

圖4 快速提取法和CTAB法獲得的水稻基因組DNA的SNP檢測結(jié)果

圖5 利用快速提取法獲得的水稻基因組DNA 進(jìn)行SSR分析

3 結(jié)論和討論

在實(shí)驗(yàn)方法不斷優(yōu)化調(diào)整的過程中，總結(jié)出如下植物基因組DNA快速提取法在操作中的注意事項(xiàng)：① 由于樣品采取量少，植物組織未完全破碎，提取到的基因組DNA濃度與CTAB法相比較低，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測微量基因組DNA時(shí)無明顯條帶產(chǎn)生，但并不影響PCR檢測；② 植物葉片薄小易緊貼在管壁，氧化鋯珠可能不易完全接觸并破碎，因此樣品破碎后需檢查破碎情況，個(gè)別樣本可能需重復(fù)破碎操作，根據(jù)實(shí)際情況選擇是否需要離心，針對比較干燥不易破碎的樣品，可先加水浸泡后再操作；③ 在揭去硅膠蓋前應(yīng)先離心，將管壁上的液體離心至管底，同時(shí)揭開硅膠蓋時(shí)須緩慢小心；④ 在PCR過程中吸取模板時(shí)要盡量吸取上清，避免吸到雜質(zhì)，以保證不影響Taq酶的活性和PCR產(chǎn)物的質(zhì)量；⑤ 對于不同的物種和同一物種不同部位的基因組DNA提取，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整氧化鋯珠數(shù)量、高通量組織破碎儀頻率及破碎時(shí)間等參數(shù)，以制備高質(zhì)量的DNA；若所得樣品較少，可使用八聯(lián)管代替96孔板，由于材料不同，破碎結(jié)果差別也較大，用八聯(lián)管經(jīng)過高通量組織研磨儀與96孔板相比，樣品破碎程度更好；⑥ 由于不同物種組織的特異性，取樣量和破碎時(shí)間稍有差別，做大批量實(shí)驗(yàn)前可先做預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定最佳實(shí)驗(yàn)方案；⑦ 為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，樣品應(yīng)避免多次反復(fù)凍融，減小對基因組DNA保存時(shí)間的影響.

本研究提出的基因組DNA快速提取方法適用于多種植物以及植物不同組織和生長狀態(tài)基因組DNA的提取，且提取到的基因組DNA片段完整，PCR擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)性好.該植物基因組DNA快速提取法可大批量、快速的對多種植物進(jìn)行基因型鑒定和品種鑒定，利用96孔板操作可提高每批次樣品檢測的通量.與CTAB法相比，該方法操作步驟簡單、耗時(shí)少，不需要使用氯仿等有毒有害的有機(jī)溶劑，對樣本的質(zhì)量要求較低，所需樣本量少，可大幅節(jié)約時(shí)間和物質(zhì)成本，提高工作效率.與XU等[15-18]提出的植物基因組DNA快速提取方法相比，本方法利用96孔板和配套的硅膠蓋能夠提高檢測通量，同時(shí)減少交叉污染.本研究對所提基因組DNA的質(zhì)量、保存時(shí)間和片段完整性進(jìn)行了檢測，并與CTAB法提取結(jié)果對比，確定兩種方法的擴(kuò)增結(jié)果無明顯差異.利用本研究方法提取不同植物物種和不同組織的基因組DNA，檢測結(jié)果均顯示良好，表明該方法對不同植物物種和不同組織具有普遍適用性，可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求.但該體系也存在一定的局限性，除本研究所檢測的水稻、玉米、擬南芥和馬鈴薯4個(gè)物種，我們也在番茄(SolanumlycopersicumL.)、花生(ArachishypogaeaL.)、白菜(BrassicarapaL.)、大豆(GlycinemaxL.)等物種中利用此方法提取了它們的基因組DNA，但實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不理想.因此，針對組織中酚和糖等含量較高植物，仍需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件[19-20]，以期提高結(jié)果的穩(wěn)定性.通過調(diào)整和優(yōu)化提取體系，該方法有望用于更多的植物物種，為遺傳多樣性研究和植物基因型鑒定等基礎(chǔ)研究提供有效技術(shù)手段.