蔗田污染物過(guò)硫酸銨和甲胺磷的快速精準(zhǔn)檢測(cè)方法探討

趙歡歡，付建濤，毛玉玲，黃衛(wèi)娟*

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2廣東省藥肥工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 引言

甘蔗是廣西、云南等地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，是當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱和蔗農(nóng)的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源，而蔗田農(nóng)藥殘留和土壤重金屬污染是制約甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中深受病蟲(chóng)草害影響，目前防治病蟲(chóng)草害多使用化學(xué)藥劑，且多數(shù)化學(xué)藥劑有一定的生物蓄積作用，對(duì)哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類及水生無(wú)脊椎動(dòng)物有毒性作用。農(nóng)藥化肥污染已成為土壤污染中面積最大、危害最大的環(huán)境污染之一，受到了社會(huì)的廣泛關(guān)注。

積極尋找蔗田農(nóng)藥、化肥殘留污染的有效快速檢測(cè)手段顯得尤為重要。目前，土壤污染物檢測(cè)方法雖然較多，包括光學(xué)檢測(cè)方法、電化學(xué)檢測(cè)法、生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)法以及氣相、液相色譜法等[1]。然而現(xiàn)有的檢測(cè)儀器報(bào)價(jià)昂貴、樣品預(yù)處理程序復(fù)雜，不僅耗時(shí)費(fèi)力耗錢，也限制了在基層農(nóng)業(yè)企業(yè)中的使用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者采用微核技術(shù)檢測(cè)具有誘變性的污水、化學(xué)藥品、農(nóng)藥等。蠶豆(Vicia f aba)作為一種理想的細(xì)胞遺傳學(xué)研究材料。蠶豆的染色體大，數(shù)量少(2n=12)，根尖中含有較多的分裂相細(xì)胞，非常適合顯微觀察，而且蠶豆根尖細(xì)胞周期中的大部分時(shí)間對(duì)誘變劑敏感，便于遺傳毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)[2]。相較之下，甘蔗根系生長(zhǎng)緩慢，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，且為多倍體，染色體數(shù)量因品種不同而差異較大，用甘蔗自身材料來(lái)檢測(cè)蔗田污染物的效果預(yù)見(jiàn)性不夠強(qiáng)，不如蠶豆根尖的檢測(cè)靈敏度高。

早在1959年，放射生物學(xué)家已經(jīng)用蠶豆的根尖細(xì)胞來(lái)進(jìn)行X射線的遺傳損傷研究[2]。到了70年代，蠶豆根尖染色體畸變技術(shù)已發(fā)展得相當(dāng)成熟，作為一種檢測(cè)化學(xué)品遺傳學(xué)毒性的方法為人們所知[3]。蠶豆根尖微(Micronucleus，MCN)技術(shù)[4]不僅具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，而且其檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果具有很高的一致性[5]。因此，1986年蠶豆根尖微核試驗(yàn)被我國(guó)環(huán)保局列為水環(huán)境生物測(cè)試的規(guī)范方法，用于檢測(cè)水體的致突變性[6]。

用微核來(lái)評(píng)價(jià)污染物、有毒物質(zhì)、藥物對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷仍是一個(gè)直觀可行的方法[7-8]。然而，對(duì)農(nóng)田土壤污染物的檢測(cè)雖有研究報(bào)道，但仍需要更多的普及應(yīng)用。本文采用蠶豆根尖微核試驗(yàn)對(duì)蔗田污染物包括過(guò)硫酸銨以及農(nóng)藥甲胺磷的誘變能力進(jìn)行檢測(cè)，分別研究?jī)烧邔?duì)蠶豆根尖細(xì)胞的誘變能力，以期為檢測(cè)蔗田污染物提供參考，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上安全合理使用農(nóng)藥和污染治理提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料的來(lái)源和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用的蠶豆種子來(lái)源于蕪湖種子市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度為(10±5)℃，自然光照條件下培養(yǎng)24 h后，再置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使用蒸餾水培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)用具和儀器準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)使用的儀器用具有：燒杯、EP管、玻璃棒、量筒、移液管、蓋玻片、載玻片、鑷子、剪刀、膠頭滴管、白瓷盤、紗布、水浴鍋、恒溫箱、顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作步驟

1.3.1 浸種、催芽

選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的燒杯中，25℃下浸泡24 h，期間換水2次。待種子吸脹后，放入用蒸餾水浸濕紗布鋪墊的白瓷盤中水培24 h，于室溫下催芽48 h再移至恒溫箱中培養(yǎng)24 h，至初生根長(zhǎng)至2 cm左右。

1.3.2 染毒

用蒸餾水將過(guò)硫酸銨配制成8種不同濃度，分別是 10000、5000、1000、500、100、10、1、0.1 mg/L。對(duì)農(nóng)藥甲胺磷用蒸餾水稀釋配置成6種濃度，分別是 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 g/L。另設(shè)蒸餾水做對(duì)照。選取發(fā)育良好，根的長(zhǎng)度約為1～2 cm的蠶豆幼苗，將幼苗分別放入裝有不同濃度甲胺磷和過(guò)硫酸銨溶液的EP管中并對(duì)各管做標(biāo)記，染毒處理24 h。同時(shí)用蒸餾水設(shè)立空白對(duì)照組。

1.3.3 固定、保存

切下0.5～1 cm長(zhǎng)的乳白色幼根放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的試管，向各試管中加入新配制的卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h。然后用蒸餾水清洗根尖后，再放入70%酒精中保存?zhèn)溆?保存時(shí)間不超過(guò)2 個(gè)月)。

1.3.4 解離

從固定液中取出蠶豆根尖，用蒸餾水漂洗，再放到0.1 mol/L HCl中，在60℃水浴中處理8 min，使根尖軟化。

1.3.5 染色和壓片

取處理好的根尖用蒸餾水漂洗數(shù)次后，置于載玻片上，用吸水紙吸去多余的液體，用刀片將根尖的分生組織切下并切碎，加1～2滴改良的堿性品紅染色5 min，進(jìn)行常規(guī)壓片。

1.3.6 鏡檢

每組各取3～5個(gè)根尖在高倍鏡下觀察，每個(gè)根尖至少觀察500～1000個(gè)細(xì)胞，并記錄發(fā)生微核的細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)參數(shù)[9]

微核千分率 MCN‰=(出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù))×1000‰。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

1.5 微核計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[10]

微核染色體的結(jié)構(gòu)和顏色深淺同主核相似。轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)時(shí)，與主核處于同一水平面；圓形或卵圓形，界限清楚，包含于胞漿中，直徑小于主核的1/3，并與主核不相連；微核完整，不重疊，但死亡或降解的細(xì)胞除外。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)硫酸銨處理對(duì)MCN‰的影響

蠶豆根尖各個(gè)處理的微核千分率(MCN‰)見(jiàn)表1。通過(guò)表中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，過(guò)硫酸銨濃度在100～1000 mg/L時(shí)，不同處理組之間的微核千分率(MCN‰)有著顯著差異(P＜0.05)；過(guò)硫酸銨濃度在 100～5000 mg/L時(shí)，不同處理組與對(duì)照組相比有著顯著差異(P＜0.05)，而當(dāng)過(guò)硫酸銨濃度達(dá)到10000 mg/L，則與對(duì)照組無(wú)顯著差異。從表1和圖1中也可以看出，隨著過(guò)硫酸銨濃度從0增加至500 mg/L時(shí)，MCN‰也在上升，表明過(guò)硫酸銨對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的毒害作用增強(qiáng)；但是，當(dāng)濃度從500 mg/L增加到1000 mg/L時(shí)，MCN‰則開(kāi)始下降，降低為10.69‰，隨著濃度進(jìn)一步增加至10000 mg/L時(shí)，MCN‰減少至僅為4.78‰。

除此以外，研究發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)微核的細(xì)胞中，微核的數(shù)量也是不同的，有1～2個(gè)，甚至有的細(xì)胞有多個(gè)微核出現(xiàn)。在對(duì)照組中常不超過(guò)5個(gè)微核，而處理組細(xì)胞中微核多在10個(gè)以上，說(shuō)明低濃度過(guò)硫酸銨對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞足以產(chǎn)生較強(qiáng)的誘變性和毒性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂受到不同程度的阻礙，表明在低濃度下過(guò)硫酸銨已經(jīng)對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的生長(zhǎng)造成了損害。

2.2 過(guò)硫酸銨處理蠶豆根尖細(xì)胞后的微核現(xiàn)象

表1 染毒24 h后不同濃度過(guò)硫酸銨對(duì)蠶豆根尖微核千分率(MCN‰)的影響

過(guò)硫酸銨處理蠶豆根尖細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生微核，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)單微核、雙微核以及三微核等，且在蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂各時(shí)相中均能觀察到微核。在10～1000 mg/L濃度范圍內(nèi)設(shè)定幾個(gè)濃度梯度，利用微核檢測(cè)進(jìn)一步檢驗(yàn)此濃度范圍內(nèi)過(guò)硫酸銨對(duì)蠶豆根尖的誘變影響的具體變化，發(fā)現(xiàn)500 mg/L過(guò)硫酸銨濃度影響下，微核總數(shù)達(dá)到最高值，為過(guò)硫酸銨對(duì)蠶豆根尖的最佳誘變濃度(圖1)。同時(shí)，經(jīng)高濃度過(guò)硫酸銨(≥100 mg/L)的誘變，顯微鏡下還能明顯觀察到染色體畸變，如染色體丟失、染色體斷片、染色體滯后等現(xiàn)象，說(shuō)明過(guò)硫酸銨處理對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞遺傳物質(zhì)造成不同程度的損傷。

圖1 不同濃度過(guò)硫酸銨對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的影響

2.3 蔗田農(nóng)藥污染物甲胺磷對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘變效應(yīng)

已有較多研究報(bào)道了農(nóng)田殺蟲(chóng)劑、除草劑等農(nóng)藥對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞有較強(qiáng)的遺傳毒性。本文以防治甘蔗綿蚜常用的甲胺磷為研究對(duì)象，基于蠶豆根尖微核試驗(yàn)的測(cè)定手段，判斷其對(duì)植物細(xì)胞誘變的遺傳毒性。從圖2可以看出，隨著處理液濃度的增加，蠶豆根尖細(xì)胞MCN‰逐步上升，尤其濃度大于0.2 g/L之后，根尖微核率快速增加，誘變作用也迅速增強(qiáng)。進(jìn)而表明高濃度的農(nóng)藥有很強(qiáng)的誘變效應(yīng)，濃度越高，毒性越大，造成的遺傳損傷也越嚴(yán)重。

3 討論

圖2 甲胺磷對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘變效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度的過(guò)硫酸銨和甲胺磷對(duì)蠶豆根尖具有較高的誘變性能，其遺傳毒害可在細(xì)胞分裂期間DNA和染色體的復(fù)制合成過(guò)程中產(chǎn)生，并以微核形式顯示[11]。各實(shí)驗(yàn)處理組和對(duì)照組的比較則表明高濃度的過(guò)硫酸銨和甲胺磷會(huì)嚴(yán)重阻礙根尖細(xì)胞分裂，其MCN‰和對(duì)照組差異不顯著，而能保證細(xì)胞具有一定程度分裂水平的處理組和對(duì)照組則差異顯著。

甘蔗生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，易受到多種病、蟲(chóng)、草、鼠等有害生物的為害等特點(diǎn)。除了本研究的兩種污染物之外，甘蔗生產(chǎn)上長(zhǎng)期使用高毒農(nóng)藥、化學(xué)肥料和除草劑等，包括呋喃丹、甲拌磷、特丁硫磷、甲基異柳磷、莠去津、乙草胺、二甲吩草胺等[12-13]，造成土壤環(huán)境的污染，仍缺乏快速便捷的檢測(cè)方法，有待微核檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用。

由于環(huán)境污染會(huì)引起植物細(xì)胞內(nèi)染色體畸變而形成微核，相對(duì)于蠶豆，甘蔗生根較慢，且對(duì)蔗田污染物具有一定的耐受性，不宜作為細(xì)胞微核檢測(cè)的優(yōu)良材料。而蠶豆根尖生長(zhǎng)迅速，對(duì)環(huán)境誘變劑敏感度較高，且染色體數(shù)量相對(duì)甘蔗較少，易于染色顯微觀察，為蔗區(qū)污染物提供了新的檢測(cè)技術(shù)參考。因此，通過(guò)蠶豆細(xì)胞微核的致畸程度，預(yù)測(cè)蔗田污染物對(duì)甘蔗生長(zhǎng)的危害具有一定的參考意義。