NaOH預(yù)處理對(duì)甘蔗渣成分和酶解效率的影響

劉 洋，胡小文，姚艷麗

(1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站，廣東湛江524013；2廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東湛江524013)

0 引言

隨著不可再生能源如石油、天然氣、煤炭等的日益枯竭，尋找新的可再生能源將是未來能源化利用的重要方向[1]?？稍偕茉粗饕ㄌ柲堋L(fēng)力、潮汐能、地?zé)崮?、生物質(zhì)能等[2]。地球上存在著大量的生物質(zhì)資源，就木質(zhì)纖維素來說，全球每年由光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維原料高達(dá)4500億t[3]，如果將這些生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成燃料乙醇，不僅可以解決部分能源短缺問題，還可以減少污染。目前可供利用的生物質(zhì)資源主要是作物秸稈，包括玉米、小麥、水稻等秸稈，但是其在收集和搬運(yùn)過程中耗費(fèi)成本較高，就目前技術(shù)而言還未形成真正的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。甘蔗是中國(guó)最大的制糖原料，南方蔗區(qū)甘蔗總產(chǎn)量7000多萬t，每年產(chǎn)生的甘蔗渣產(chǎn)量約為2000多萬t[4]。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的產(chǎn)物，利用其生產(chǎn)燃料乙醇不僅可以實(shí)現(xiàn)廢棄物的再利用，更極大地避免了因直接燃燒而帶來的環(huán)境污染問題，同時(shí)甘蔗渣收集簡(jiǎn)單，成本較低，因此利用甘蔗渣生產(chǎn)燃料乙醇具有廣闊的發(fā)展前景[5]。

和其他生物質(zhì)原料一樣，甘蔗渣成分主要包括木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、灰分等，由于甘蔗渣原料的組成及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，木質(zhì)素和纖維素、半纖維素纏繞在一起形成晶體結(jié)構(gòu)，阻礙了纖維素酶與底物的接觸，大大降低了酶解效果[6]，因此必須采取預(yù)處理手段才能打破原有的晶體結(jié)構(gòu)提高其酶解能力?，F(xiàn)有的預(yù)處理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法、生物法等[7]，其中堿處理可以在低溫條件下進(jìn)行，不僅纖維素和半纖維素?fù)p失少，而且無抑制產(chǎn)物形成，受到了廣泛關(guān)注[8]。在堿性環(huán)境下，半纖維素及木質(zhì)素分子間的酯鍵發(fā)生皂化，酯鍵的斷裂引起木質(zhì)素溶解，同時(shí)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間的孔隙增大，造成纖維素溶脹和結(jié)晶度降低等[9]，因此NaOH可以有效地去除木質(zhì)素，使纖維素潤(rùn)脹，有利于提高酶解效率[10]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理溫度、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)及預(yù)處理時(shí)間對(duì)酶解和發(fā)酵效率影響較為顯著，經(jīng)過NaOH預(yù)處理后的甘蔗渣比表面積顯著增加，木質(zhì)素顯著降低[11]。在低濃度的NaOH溶液范圍內(nèi)，甘蔗渣的結(jié)晶度值升高，當(dāng)NaOH溶液濃度再升高時(shí)，甘蔗渣纖維素的結(jié)晶度值下降[12]。研究還發(fā)現(xiàn)，NaOH預(yù)處理可以有效提高甘蔗渣的酶解效率，促進(jìn)低聚木糖的生產(chǎn)[13]。雖然前人在NaOH預(yù)處理甘蔗渣做了一些研究，但是仍有一些問題需要進(jìn)一步研究和改進(jìn)。一是在不同的NaOH濃度、溫度、處理時(shí)間和固液比條件下，甘蔗渣成分和物理結(jié)構(gòu)如何變化；二是預(yù)處理?xiàng)l件是否可以更加優(yōu)化。針對(duì)這2個(gè)問題，本文在前人研究的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)分析不同NaOH預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)甘蔗渣成分、固體得率、物理結(jié)構(gòu)和酶解效率的影響，期望能為今后開展甘蔗渣乙醇生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘蔗渣來自湛江大華甘蔗制糖企業(yè)，在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

纖維素酶購買自Solarbio公司，檸檬酸、檸檬酸鈉、3, 5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚和無水亞硫酸氫鉀購買自上海麥克林公司，所用試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

FW100泰斯特粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-75KBS申安高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；723PCS鳳凰紫外可見分光光度計(jì)，上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；SHZ-DIII予華牌循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DHG-9123A鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-6金壇華立恒溫水浴鍋，金壇市華立實(shí)驗(yàn)儀器廠；RU-T-15超純水系統(tǒng)，上海同田儀器有限公司；THZ-82國(guó)立恒溫氣浴搖床，常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所；JA3003N電子天秤，上海菁海儀器有限公司；DS3200普洛帝超聲波振蕩器，陜西普洛帝測(cè)控技術(shù)有限公司；JY100喬躍雪花制冰機(jī)，上海喬躍電子有限公司；H1850R湘儀冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；S-3700N掃描電子顯微鏡，日本HITACHI公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 NaOH濃度的實(shí)驗(yàn)方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分別加入濃度為7%、9%、10%、11%、13%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后在水浴鍋內(nèi)50℃下反應(yīng)30 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.2 處理溫度的實(shí)驗(yàn)方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分別加入濃度為9%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后分別在水浴鍋內(nèi)30、40、50、60、70℃下反應(yīng)30 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.3 固液比的實(shí)驗(yàn)方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按固液比1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16(g/mL)分別加入濃度為 9%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后在水浴鍋內(nèi)50℃下反應(yīng)30 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.4 處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分別加入濃度為9%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后在水浴鍋內(nèi)50℃下分別反應(yīng)10、20、30、40、50 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.5 甘蔗渣成分的測(cè)定

甘蔗渣成分分析甘蔗渣中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量測(cè)定參考國(guó)際生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass》[14]，木質(zhì)素的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB/T 747-2003[15]。

1.4.6 固體得率的測(cè)定

試樣經(jīng)NaOH處理后固體部分用蒸餾水沖洗至中性，用G3號(hào)砂芯漏斗抽濾，于105℃烘箱烘至恒重，計(jì)算其固體得率。

固體得率(%)=(處理后樣品重/處理前樣品重)×100%。

1.4.7 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)處理前后的甘蔗渣樣品進(jìn)行鍍金處理，然后利用掃描電子顯微鏡觀察樣品的物理表面特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，選擇聚焦距離為10 μm和50 μm拍照記錄并保存。

1.4.8 纖維素酶液的制備

稱取商品干粉纖維素酶(3 units/mg)1.650 g，用檸檬酸緩沖溶液配制100 mL酶液。配制檸檬酸鈉緩沖液0.05 mol/L pH 4.8，所用的檸檬酸、檸檬酸鈉試劑均為分析純。配制方法如下：首先分別配制A、B液，然后按一定比例混合。A液(檸檬酸溶液 0.1 mol/L)：精確稱取C6H8O7(MW=210.14)試劑21.014 g置于250 mL燒杯中，加入適量蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓D(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶并多次漂洗，用蒸餾水定容后混勻，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。B液(檸檬酸鈉溶液0.1 mol/L)：精確稱取 Na3C6H5O7·2H2O(MW=294.12)試劑29.412 g置于250 mL燒杯中，加入適量蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶并多次漂洗，用蒸餾水定容后混勻，同樣放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。量取A液27.12 mL和B液22.88 mL使其充分混合，移入 100 mL容量瓶定容至刻度，充分混勻，得到0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液，于4℃冰箱中保存，用于測(cè)定濾紙酶活。

1.4.9 酶活性測(cè)定

酶解反應(yīng)在100 mL三角瓶中進(jìn)行，取預(yù)處理后絕干重為1 g的甘蔗渣作為酶解底物，以固液比1︰16，加入 pH為 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，纖維素酶用量為20 FPU/g(絕干底物)，在50℃，100 r/min的恒溫振蕩器中反應(yīng)48 h。酶解完成后，沸水浴10 min終止酶解反應(yīng)，冰水冷卻，于12000 r/min離心5 min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)測(cè)還原糖和糠醛含量，過濾并洗滌酶解固體，風(fēng)干后保存于密封袋，用于后續(xù)檢測(cè)。測(cè)定纖維素酶酶活以FPU/mL表示，定義為：在 50℃條件下 60 min內(nèi)分解濾紙產(chǎn)生 1 μmol葡萄糖為1個(gè)活力單位。酶活測(cè)定依照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》[16]。β-葡萄糖苷酶酶活單位(U/mL)定義為：在測(cè)定條件(pH值5.0，50℃±2℃)下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活單位。酶活測(cè)定方法參考韋斌如建立的 pNPG比色法[17]。還原糖濃度測(cè)定采用 DNS法(3, 5-二硝基水楊酸法)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同堿處理對(duì)甘蔗渣主要成分的影響

圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同堿濃度對(duì)半纖維素和纖維素影響較大，隨著堿濃度的增加，半纖維素和纖維素含量逐漸降低，在堿濃度為7%時(shí)，半纖維素含量和纖維素含量均最高，分別為 16.85%和45.63%；在堿濃度為13%時(shí)，半纖維素含量和纖維素含量均最低，分別為9.87%和37.56%。木質(zhì)素含量也隨著堿濃度的增大而逐漸降低，但變化相對(duì)較小，變化范圍為15.23%～17.85%(圖1)。

不同處理溫度對(duì)半纖維素影響最大，當(dāng)溫度上升到50℃以上時(shí)，半纖維素含量迅速下降，在溫度為70℃時(shí)，半纖維素含量最低，為8.25%。纖維素含量隨著溫度的上升呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，在溫度為70℃時(shí)，纖維素含量最低，為35.65%。木質(zhì)素含量雖然隨著溫度的升高呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，但變化不是十分明顯，變化范圍15.98%～18.55%(圖2)。

圖1 不同堿濃度對(duì)甘蔗渣成分的影響

圖2 不同堿處理溫度對(duì)甘蔗渣成分的影響

相比堿濃度和溫度，固液比對(duì)甘蔗渣主要成分的影響趨勢(shì)有所不同。無論是半纖維素、纖維素還是木質(zhì)素含量都呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。在固液比為1︰12時(shí)，半纖維素含量最低，為10.56%，在固液比為1︰14時(shí)，纖維素和木質(zhì)素含量最低，分別為40.33%和15.63%。在固液比為1︰8時(shí)，半纖維素含量、纖維素含量和木質(zhì)素含量均最高，分別為 16.35%、45.83%和 17.55%(圖 3)。

圖3 不同堿處理固液比對(duì)甘蔗渣成分的影響

隨著處理時(shí)間的增加，纖維素含量和木質(zhì)素含量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，處理時(shí)間從10 min到50 min，纖維素含量由46.12%下降到38.25%，木質(zhì)素含量由18.24%下降到15.23%。半纖維素含量在處理40 min后達(dá)到最低為10.03%(圖4)。

圖4 不同堿處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣成分的影響

利用NaOH預(yù)處理甘蔗渣，不同的處理?xiàng)l件對(duì)甘蔗渣成分均存在一定程度的影響。隨著NaOH濃 度、溫度和處理時(shí)間的增加，半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)?，用NaOH處理甘蔗渣可以破壞細(xì)胞壁溶解半纖維素和木質(zhì)素通過水解成為糖醛酸和乙酸酯，降低纖維素的結(jié)晶度。NaOH濃度和處理溫度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，通過該方法，可以將甘蔗渣簡(jiǎn)單地分餾成堿溶性木質(zhì)素、半纖維素和殘留物，利用它們獲得更有價(jià)值的產(chǎn)品。甘蔗渣經(jīng)過NaOH預(yù)處理可以消化木質(zhì)素，并使纖維素和半纖維素用于水解[19]。研究發(fā)現(xiàn)用1%和3%NaOH溶液連續(xù)處理甘蔗渣，可從蔗渣中得到 25.1%半纖維素，占原始半纖維素的74.9%[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同固液比對(duì)甘蔗渣成分影響較小，表明固液比不是NaOH預(yù)處理甘蔗渣的關(guān)鍵因素。

2.2 不同堿處理對(duì)甘蔗渣固體得率的影響

不同堿濃度對(duì)甘蔗渣固體得率有一定影響，但變化不明顯，堿濃度處理固體得率在 53.2%～61.12%之間，10%左右的堿濃度固體得率最低圖5)。不同溫度對(duì)甘蔗渣固體得率影響較大，在30℃時(shí)，甘蔗渣固體得率最高為98.25%，在50℃時(shí)，甘蔗渣固體得率最低為54.2%(圖6)。而不同固液比和處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣固體得率幾乎沒有影響(圖7和圖8)。

本研究發(fā)現(xiàn)，處理溫度為50℃時(shí)，固體得率最低，而過低或者過高的溫度都會(huì)使固體得率升高。這是由于溫度過低時(shí)，不利于化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，固體降解速率較低。但是溫度過高會(huì)降低NaOH對(duì)半纖維素和纖維素的化學(xué)作用，從而保持一個(gè)較高的固體得率水平。

2.3 不同堿處理對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)的影響

圖5 不同堿濃度對(duì)甘蔗渣預(yù)處理固體得率的影響

圖6 不同堿處理溫度對(duì)甘蔗渣預(yù)處理固體得率的影響

圖7 不同堿處理固液比對(duì)甘蔗渣預(yù)處理固體得率的影響

圖8 不同堿處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣預(yù)處理固體得率的影響

對(duì)不同堿處理后的甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行電鏡照相，結(jié)果表明：不同堿濃度、溫度、固液比和處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)都有不同程度的影響。從結(jié)果可以看到對(duì)照樣品蔗渣原料結(jié)構(gòu)完整緊密，纖維素束排列有序，原料表面光滑、平整，幾乎看不到內(nèi)部形態(tài)(圖9)。而用濃度10%或13%的NaOH處理后，可清晰觀察到蔗渣結(jié)構(gòu)受到破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，表面剝離出纖維碎片，多處出現(xiàn)小孔(圖 10)。70℃處理甘蔗渣后可以觀察到，甘蔗渣表面出現(xiàn)多個(gè)孔洞，甚至出現(xiàn)較大的縫隙，木質(zhì)素和纖維素結(jié)構(gòu)已基本破壞。不同固液比對(duì)甘蔗渣處理后甘蔗渣表面出現(xiàn)一定程度的破壞，但效果不明顯，大部分結(jié)構(gòu)還保持原狀(圖 11)。處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣影響較大，處理30 min后甘蔗渣表面開始出現(xiàn)小孔，進(jìn)一步處理后蔗渣表面變得更加崎嶇、凹凸不平，纖維出現(xiàn)部分剝離，表面小孔變多變密(圖12)。

使用NaOH預(yù)處理甘蔗渣后，甘蔗渣的物理結(jié)構(gòu)破壞比較嚴(yán)重，綜合來看，NaOH濃度、處理時(shí)間和溫度對(duì)物理結(jié)構(gòu)影響較大。這是因?yàn)楦收嵩肜w維素在纖維細(xì)胞壁的分布以次生壁外層濃度最大，而且半纖維素以粘合劑方式存在于細(xì)胞壁各薄層間，因而半纖維素脫除后，會(huì)使纖維細(xì)胞壁嚴(yán)重分層。使得原料表面變得粗糙，組分溶出而出現(xiàn)小孔[21]。進(jìn)一步酶解后，蔗渣表面變得更加崎嶇、凹凸不平，纖維出現(xiàn)部分剝離，表面小孔變多變密?？梢杂^察到，酶解后的原料殘?jiān)慕Y(jié)構(gòu)仍較完整，這是由于酶解后的蔗渣仍含有較多未被水解的纖維素，它們?nèi)员荒举|(zhì)素緊密連接在一起。

圖9 不同堿濃度對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)的影響

圖10 不同堿處理溫度對(duì)甘蔗物理結(jié)構(gòu)的影響

圖11 不同堿處理固液比對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)的影響

圖12 不同堿處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)的影響

圖13 不同堿濃度對(duì)甘蔗渣酶解效率的影響

2.4 不同堿處理對(duì)酶解效率的影響

利用不同預(yù)處理?xiàng)l件下的 NaOH預(yù)處理甘蔗渣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：隨著NaOH濃度的增加，酶與纖維素內(nèi)部及表面積逐漸增加，從而使還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加；當(dāng)NaOH濃度增加到10%后，隨著濃度的繼續(xù)增加，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降(圖13)。所以選擇堿濃度為 10%。隨著溫度的升高，木質(zhì)素越易脫除，還原糖含量不斷地增加；當(dāng)溫度上升至50℃以后，還原糖含量下降(圖 14)。因此，選擇溫度為50℃。隨著固液比的增加，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，當(dāng)固液比為1︰16時(shí)，略有升高，這是因?yàn)楫?dāng)固液比低于1︰8時(shí)，木質(zhì)素不易被脫除，當(dāng)增加到一定程度后，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與固液比達(dá)到一個(gè)平衡點(diǎn)，所以最佳固液比為 1︰16(圖 15)。如果處理時(shí)間太短，NaOH不能完全脫除木質(zhì)素，影響水解效率；如果處理時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使纖維素部分溶解而減少處理液中的糖含量。考慮到糖產(chǎn)量和節(jié)約時(shí)間，選擇處理時(shí)間為30 min左右(圖16)。

和甘蔗渣成分相比較，酶解過程更為復(fù)雜，過高的NaOH濃度、預(yù)處理溫度和時(shí)間都會(huì)阻礙酶解的進(jìn)行。隨著濃度增加，有效堿對(duì)碳水化合物的損害作用增加，多余的NaOH會(huì)使纖維素遭到破壞。當(dāng)溫度上升至50℃以后，還原糖含量下降，這是因?yàn)楫?dāng)溫度升高到一定值時(shí)，部分還原糖容易發(fā)生分解反應(yīng)，生成糠醛等副產(chǎn)物，使還原糖含量降低，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降。經(jīng)過不同處理對(duì)甘蔗渣處理的結(jié)果，得出最佳的處理?xiàng)l件為：NaOH濃度10%，溫度50℃，固液比1︰16，處理時(shí)間30 min。在這個(gè)條件下，甘蔗渣降解成還原糖的效率最高，還原糖濃度大約在16%左右。

圖14 不同溫度對(duì)甘蔗渣酶解效率的影響

圖15 不同固液比對(duì)甘蔗渣酶解效率的影響

圖16 不同處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣酶解效率的影響

3 結(jié)論

本文利用NaOH預(yù)處理甘蔗渣，通過不同濃度、溫度、固液比和處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣成分含量、固體得率、物理結(jié)構(gòu)和酶解效率進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：NaOH濃度、預(yù)處理溫度和預(yù)處理時(shí)間是影響甘蔗渣成分的關(guān)鍵因素。處理溫度對(duì)固體得率影響較大，而濃度、固液比和處理時(shí)間的影響不明顯。不同堿濃度、溫度、固液比和處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)都有不同程度的影響，處理后的甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)受到破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得疏松多孔。根據(jù)酶解效率實(shí)驗(yàn)得出的最佳預(yù)處理?xiàng)l件為：濃度10%、溫度50℃、固液比1︰16、處理時(shí)間30 min，其預(yù)處理甘蔗渣產(chǎn)物還原糖濃度在16%左右。