張鶴達(dá), 李偉, 鐘山亮, 姜林宏, 李建, 唐金海

根據(jù)2012年全球癌癥統(tǒng)計顯示,2012年估計有170萬乳腺癌新發(fā)病例和52萬的乳腺癌死亡人數(shù),分別占女性癌癥總發(fā)病率的25%和女性癌癥死亡總數(shù)的15%,成為女性最常見的癌癥,也是癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步,乳腺癌的治療手段也逐漸增加,但是仍不能徹底阻斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移,因此我們需要迫切深入了解乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制,為乳腺癌更有效地治療提供新的方向。

環(huán)狀RNA是一類新穎的單鏈、內(nèi)源性RNA分子,通過與miRNA或其他分子結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因的表達(dá)。環(huán)狀RNA在多種腫瘤中異常調(diào)節(jié),并參與重要的生物學(xué)功能的調(diào)控,包括細(xì)胞凋亡、增殖、遷移侵襲和腫瘤形成等[2-4]。因此環(huán)狀RNA將成為新的腫瘤標(biāo)志物。

乳腺癌常見的分子分型主要分為四類,分別是Luminal A型、Luminal B型、HER2陽性型和三陰性,其中Luminal A型乳腺癌占的比重較大,其次是三陰性乳腺癌,而且相對于Luminal A型乳腺癌,三陰性乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高,預(yù)后差,生存率低[5-6]。因此我們將通過分析GEO數(shù)據(jù)中Luminal A型和三陰性乳腺癌組織樣本環(huán)狀RNA的表達(dá)水平,進(jìn)一步探索環(huán)狀RNA在乳腺癌侵襲遷移中的作用,為乳腺癌治療和轉(zhuǎn)移預(yù)防提供新的前景。

1 材料和方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù) 原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE101124是從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載的。從GSE101124數(shù)據(jù)集中共獲得4對Luminal A型乳腺癌組織和4對三陰性乳腺癌組織,并通過GPL 19978 Agraystar HumanCircRNA芯片V1平臺進(jìn)行分析,共分析了4 229個環(huán)狀RNA。

1.2 GEO數(shù)據(jù)分析 差異表達(dá)基因是通過R軟件中的limma軟件包(版本3.4.4;http://www.r-project.org)確定,讀取原始數(shù)據(jù),對背景進(jìn)行校正和歸一化。與陰性對照相比,至少50%的基因芯片的探針的信號強(qiáng)度比陰性對照高10%。然后對微陣列權(quán)值進(jìn)行估測,并將其應(yīng)用到線性模型分析中,采用t檢驗方法鑒定Luminal A型和三陰性乳腺癌之間差異表達(dá)基因。采用Benjamini-Hochberg方法進(jìn)行多次比較,以倍數(shù)差異≥2和調(diào)整后的P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行后續(xù)篩選。

1.3 環(huán)狀RNA/miRNAs相互作用 利用miRanda和RNAhybrid 軟件預(yù)測環(huán)狀RNA與miRNA可能的結(jié)合位點。利用Cytoscape軟件構(gòu)建差異表達(dá)的環(huán)狀RNA/miRNAs的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因在乳腺癌中的表達(dá) 通過來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的UALCAN在線軟件分析環(huán)狀RNA的親本基因在乳腺癌組織中的表達(dá),推測環(huán)狀RNA與親本基因的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)的環(huán)狀RNA 通過對Luminal A型和三陰性乳腺癌組織進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)共有27個環(huán)狀RNA差異表達(dá),與Luminal A型相比,在三陰性乳腺癌組織中有6個環(huán)狀RNA上調(diào),21個環(huán)狀RNA下調(diào),見圖1A,表1、表2。通過繪制火山圖,更直接的顯示環(huán)狀RNA的差異倍數(shù)以及統(tǒng)計意義,見圖1B。然后對差異的環(huán)狀RNA進(jìn)行聚類分析,見圖1C,每行表示差異的環(huán)狀RNA,每個垂直列對應(yīng)于乳腺癌樣本。

2.2 預(yù)測環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用 根據(jù)miRNA種子區(qū)堿基互補配對,通過miRanda 軟件和RNAhybrid軟件對環(huán)狀RNA可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行預(yù)測,構(gòu)建環(huán)狀RNA/miRNAs之間的聯(lián)絡(luò)網(wǎng)。通過對在三陰性乳腺癌組織中上調(diào)的6個環(huán)狀RNA進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001666吸附的miRNAs最多,達(dá)135個,其次是hsa_circ_0003611,有69個可結(jié)合的miRNAs,而且hsa_circ_0001666與其他環(huán)狀RNA共同作用的miRNAs的數(shù)量也最多,其中與hsa_circ_0003511共同作用的miRNAs有12個(圖2A)。對在三陰性乳腺癌組織中下調(diào)的前10個環(huán)狀RNA進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000965所結(jié)合的miRNAs最多,高達(dá)255個,其次是hsa_circ_0001907,可與211個miRNAs結(jié)合,而且hsa_circ_0000965和hsa_circ_0001907共同的作用miRNAs也最多,包含75個miRNAs。同時發(fā)現(xiàn)miR-5787可以被6個環(huán)狀RNA共同作用(hsa_circ_0000965,hsa_circ_0000288,hsa_circ_0001907,hsa_circ_0005664,hsa_circ_0038645,hsa_circ_0020594);miR-1254,miR-4656,miR-4722-5p,miR-612,miR-6756-5p,miR-6803-5p,miR-6882-3p,miR-762可以被5個環(huán)狀RNA共同作用。因此構(gòu)建環(huán)狀RNA/miRNAs網(wǎng)絡(luò)將會更直接的觀察其相互聯(lián)系,為環(huán)狀RNA通路機(jī)制的研究提供了重要的信息。

1A:Luminal A型和三陰性乳腺癌組織之間環(huán)狀RNA微陣列信號值的散點圖,與Luminal A型乳腺癌組織相比,紅點代表上調(diào)的環(huán)狀RNA,綠色點代表下調(diào)的環(huán)狀RNA,黑點代表無明顯意義的圓環(huán)RNA;1B:火山圖,垂直線對應(yīng)于差異倍數(shù)為2倍或1/2的分割線,水平線代表P值為0.05,圖中的紅點代表差異表達(dá)的環(huán)狀RNA;1C:差異表達(dá)的環(huán)狀RNA的熱圖,根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)對環(huán)狀RNA進(jìn)行分類,顏色等級從綠色(低強(qiáng)度)到黑色(中等強(qiáng)度),再到紅色(高強(qiáng)度)圖1 篩選差異表達(dá)的環(huán)狀RNA

表1 在三陰性乳腺癌組織中下調(diào)的環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA親本基因P值倍數(shù)差異 hsa_circ_0000086ST6GALNAC30.0005914.158422 hsa_circ_0000965C19orf180.0045413.722668 hsa_circ_0001907LOC1005074120.0036373.51351 hsa_circ_0005664CAPZA10.0049072.875769 hsa_circ_0005516RGS100.0006442.651565 hsa_circ_0020594-0.0010832.500509 hsa_circ_0000288CAPRIN10.0282242.442410 hsa_circ_0000523METTL30.0041912.408066 hsa_circ_0033010LGMN0.0029222.400354 hsa_circ_0038645PRKCB0.0059162.364240 hsa_circ_0006220TADA2A0.0426382.347079 hsa_circ_0044234CDC270.0130022.325888 hsa_circ_0005221NPLOC40.0145892.293956 hsa_circ_0000849DYM0.0016412.291298 hsa_circ_0050205MEF2BNB-MEF2B0.0356912.262669 hsa_circ_0000977NOL100.0152082.158794 hsa_circ_0054254EML40.0363722.138124 hsa_circ_0058451ACSL30.0031392.102548 hsa_circ_0001421SEC31A0.0005522.097744 hsa_circ_0007380NSUN20.0162282.068703 hsa_circ_0008086CDKAL10.0434282.025271

表2 在三陰性乳腺癌中組織上調(diào)的環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA親本基因P值倍數(shù)差異 hsa_circ_0078153STXBP50.0125742.01165 hsa_circ_0007762STXBP50.0159782.205221 hsa_circ_0001666FAM120B0.0013342.246033 hsa_circ_0003511LMBR10.0381662.502945 hsa_circ_0003611LPAR10.0441922.503140 hsa_circ_0091994FLNA0.0327722.931248

2.3 環(huán)狀RNA與親本基因的關(guān)系 通過UALCAN分析發(fā)現(xiàn),與luminal型乳腺癌組織相比,C19orf18、METTL3、CDC27和ACSL3在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào),見圖3A。FLNA在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),見圖3B,均與其相對應(yīng)的環(huán)狀RNA的表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

隨著對環(huán)狀RNA的不斷研究,發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA不僅在多種腫瘤中異常調(diào)節(jié),而且廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7],尤其在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起到了重要的作用。如hsa_circRNA_103809通過海綿miR-4302,上調(diào)了miR-4302的靶基因ZNF121的表達(dá),從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲[8];hsa_circ_0016788通過調(diào)控miR-486/CDK4途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲[9];circHIPK3通過抑制miR-7促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移[10]。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是癌癥患者最主要的死亡原因,也是目前治療的難點。因此本研究主要是通過對GEO數(shù)據(jù)庫中4對Luminal A型乳腺癌組織和4對三陰性乳腺癌組織中的環(huán)狀RNA進(jìn)行相關(guān)分析,為環(huán)狀RNA在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究中提供新觀念。通過分析發(fā)現(xiàn)與Luminal A型乳腺癌組織相比,在三陰性乳腺癌組織中共有6個環(huán)狀RNA上調(diào),21個環(huán)狀RNA下調(diào)。然后我們對異常表達(dá)的環(huán)狀RNA可結(jié)合的下游miRNAs進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在上調(diào)的環(huán)狀RNA中,hsa_circ_0001666吸附的miRNAs最多,而且hsa_circ_0001666均可以與hsa_circ_0078153、hsa_circ_0007762、hsa_circ_0003511、hsa_circ_0003611和hsa_circ_0091994共同調(diào)控部分miRNAs。同時在下調(diào)的環(huán)狀RNA中,hsa_circ_0000965海綿的miRNAs最多,且同hsa_circ_0001907共同作用的miRNAs也最多。因此我們推測hsa_circ_0001666和hsa_circ_0000965具有較強(qiáng)的吸附作用。除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)miR-5787可以被6個環(huán)狀RNA共同作用,miR-1254,miR-4656,miR-4722-5p,miR-612,miR-6756-5p,miR-6803-5p,miR-6882-3p,miR-762可以被5個環(huán)狀RNA共同作用,預(yù)示著這些miRNAs可能是侵襲力較強(qiáng)的因子,通過調(diào)控下游靶基因促進(jìn)乳腺癌的遷移侵襲。而且通過文獻(xiàn)查找發(fā)現(xiàn)miR-762可以通過抑制IRF7的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11];miR-1254通過靶向RASSF9促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,抑制凋亡[12],然而miR-1254以及其他miRNAs在乳腺癌細(xì)胞中的遷移侵襲作用并未研究。因此在后續(xù)的研究中不僅需要雙熒光素酶實驗驗證環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用,還需要證實miRNAs在乳腺癌中的侵襲遷移作用。

2A:預(yù)測三陰性乳腺癌組織中上調(diào)的6個環(huán)狀RNA與miRNAs的相互作用;2B:預(yù)測三陰性乳腺癌組織中下調(diào)的前10個環(huán)狀RNA與miRNAs的相互作用圖2 預(yù)測環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用

3A:C19orf18、METTL3、CDC27和ACSL3在三陰性乳腺癌組織中表達(dá);3B:FLNA在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)圖3 環(huán)狀RNA與親本基因的關(guān)系

最近研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA可以調(diào)控其親本基因的表達(dá),如在食管鱗狀細(xì)胞癌中,隨著circRNA ITCH的表達(dá)增加,ITCH的表達(dá)也增加[13];circGFRA1在乳腺癌中沉默后,GFRA1的表達(dá)也隨之下調(diào)[14]。此外,circITGA7,作為一個抑癌基因,不僅可以通過海綿miR-370-3p上調(diào)NF1的表達(dá),也可以通過抑制與RAS信號相關(guān)的剪接轉(zhuǎn)錄因子RREB1來上調(diào)其親本基因ITGA7的表達(dá),從而抑制結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移[18],并且通過組織分析發(fā)現(xiàn)circITGA7 和 ITGA7的表達(dá)呈正相關(guān),因此環(huán)狀RNA也可以通過上調(diào)親本基因調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能[15]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)C19orf18、METTL3、CDC27和ACSL3在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào),FLNA在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),與hsa_circ_0000965、hsa_circ_0000523、hsa_circ_0044234、hsa_circ_0058451和hsa_circ_0091994在乳腺癌組織中表達(dá)一致,預(yù)示著這些環(huán)狀RNA可能正向調(diào)控其親本基因,但是其具體發(fā)生機(jī)制仍待后續(xù)研究。

綜上所述,用生物信息學(xué)的方法分析Luminal A型和三陰性乳腺癌組織中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA,并建立了環(huán)狀RNA/miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò),同時發(fā)現(xiàn)部分環(huán)狀RNA的表達(dá)與其親本基因呈正相關(guān),這為乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療提供新的思路。但是其分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究證實。