張明芳，王金晶，鈕成拓，鄭飛云，劉春鳳，李崎*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

酵母含有豐富的蛋白質(zhì)(45%～60%)、氨基酸、B族維生素、多糖、礦物質(zhì)等，其自溶物被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、化妝品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。酵母自溶物是利用酵母自溶的特性，降解菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸類等物質(zhì)得到的產(chǎn)品[2]。目前生產(chǎn)酵母自溶物的原料主要來(lái)自于啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母這3大食用酵母。國(guó)內(nèi)主要以面包酵母生產(chǎn)為主，但由于我國(guó)具有豐富的啤酒酵母資源，近年來(lái)對(duì)于啤酒酵母的開(kāi)發(fā)也引起了關(guān)注[3]。

酵母自溶物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包含多糖、多肽、核苷酸及其他可溶性物質(zhì)。多糖主要是由于細(xì)胞壁降解得到的。細(xì)胞壁多糖組分中的葡聚糖是主要的活性物質(zhì)之一，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、保護(hù)皮膚細(xì)胞免受環(huán)境污染、延緩細(xì)胞衰老等功能[4]，除了具有生物活性之外，β-葡聚糖還有改善食品風(fēng)味的作用。在葡萄酒陳釀過(guò)程中，酵母細(xì)胞溶出的β-葡聚糖能夠改善酒體口感和泡沫穩(wěn)定性，因此在葡萄酒釀造中往往需要促進(jìn)β-葡聚糖的溶出[5]或添加酵母多糖[6]。在酸奶中添加β-葡聚糖還有助于提高酸奶的感官接受度[7]。而多肽是酵母自身酶系降解大分子蛋白質(zhì)得到的。酵母多肽由于分子量小，不僅易于吸收和利用，還具有調(diào)節(jié)免疫力，抗氧化等功能[8]。因此，富含生物活性物質(zhì)和較高抗氧化活性的酵母自溶液具有作為功能性食品或營(yíng)養(yǎng)成分的潛在應(yīng)用價(jià)值[9]。

工業(yè)上生產(chǎn)酵母自溶物普遍采用自溶法。通過(guò)優(yōu)化自溶時(shí)間[10]、溫度[11]、pH和添加助溶劑[12]可促進(jìn)酵母的自溶，其中溫度是影響較大的因素。但是傳統(tǒng)的自溶溫度較高(45～55 ℃)，不利于維持多肽及氨基酸等活性物質(zhì)天然結(jié)構(gòu)[13]。據(jù)報(bào)道，啤酒酵母在36 ℃下自溶6 h可獲得具有最高抗氧化活性的酵母自溶物[14]。目前，對(duì)于提高酵母自溶物抗氧化活性的研究多集中于自溶條件的優(yōu)化，而對(duì)直接改造酵母菌株自溶性能的研究較少。

為了促進(jìn)酵母自溶、提高自溶物中活性物質(zhì)的含量和抗氧化活性，本研究通過(guò)常溫等離子誘變(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)手段，以啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母為出發(fā)菌株，篩選出了3株在37 ℃下快速自溶的高溫敏感型酵母，比較了原始菌與突變菌的自溶程度差異，并分析了自溶物活性物質(zhì)溶出和抗氧化性的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

啤酒酵母pilsner、安琪面包酵母AQ和葡萄酒酵母D254均為工業(yè)酵母菌株；高溫敏感型酵母P-510、A-14、D-12分別由pilsner、AQ、D254篩選得到；以上菌株均保藏于實(shí)驗(yàn)室。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，葡萄糖20。固體培養(yǎng)基添加瓊脂量為20。

1.1.2 試劑

酵母提取物、蛋白胨，生工生物工程(上海)股份有限公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，Sigma-Aldrich公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、甘氨酸、NaOH，HCl，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP誘變系統(tǒng)，思清源生物科技有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；NanoDrop分光光度計(jì)，Thermo Scientific賽默飛世爾科技公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；CX21顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Tecan Infinite 200多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；DC-0506恒溫水浴槽，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BCIP平板篩選

高溫敏感型酵母細(xì)胞受到熱脅迫后易發(fā)生自溶，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)溶出。因此利用胞內(nèi)堿性磷酸酶與5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,BCIP)反應(yīng)生成藍(lán)色沉淀這一原理，可根據(jù)藍(lán)色出現(xiàn)時(shí)間與深淺進(jìn)行突變菌的篩選。BCIP平板篩選方法如圖1所示。將對(duì)數(shù)期的酵母菌液洗滌后用生理鹽水重懸稀釋，使菌液細(xì)胞數(shù)達(dá)107個(gè)/mL。取上述菌懸液10 μL點(diǎn)于ARTP誘變載片上進(jìn)行誘變處理，功率100 W，氣流量10 SLM。將經(jīng)過(guò)ARTP誘變所得到的菌液稀釋10倍，涂布于含有40 mg/L BCIP的YPD平板，28 ℃培養(yǎng)36 h。通過(guò)平板影印法將菌落復(fù)制于YPD平板，并將其放置于28 ℃培養(yǎng)，同時(shí)將含有40 mg/L BCIP的YPD平板放置于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選菌落顏色變藍(lán)的單菌落進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.3.2 酵母生長(zhǎng)性能考察與生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

(1)生長(zhǎng)狀況分析：將待測(cè)菌株28 ℃培養(yǎng)12 h后取1 mL離心，去上清并洗滌。使用血球平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)后將菌液濃度調(diào)為106、105、104、103個(gè)/mL。依次取4個(gè)稀釋度的菌液3 μL點(diǎn)種在YPD平板上，分別放置于28和37 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落大小。

(2)死亡率測(cè)定：菌株于28 ℃培養(yǎng)24 h至生長(zhǎng)穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)移至37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，測(cè)定0～72 h間細(xì)胞死亡率。菌液用無(wú)菌水洗滌后取0.5 mL與0.5 mL亞甲基紫染色液混合，15 min后細(xì)胞計(jì)數(shù)，紫色細(xì)胞為死亡細(xì)胞[15]。

(3)生長(zhǎng)曲線測(cè)定：菌種于20 mL YPD培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，以5%接種量接種至100 mL YPD中，每隔2 h測(cè)定OD600，14 h后每隔4 h測(cè)定OD600，直至菌體生長(zhǎng)至平臺(tái)期。

1.3.3 自溶液中核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定

收集5.00 g酵母泥，并加入50 mL檸檬酸緩沖液(pH 4.0)中，于180 r/min、37 ℃自溶48 h，測(cè)定上清液核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮的含量。

核酸含量測(cè)定：吸取上清2 μL使用微量分光光度計(jì)NanoDrop[16]測(cè)定RNA含量(ng/μL)。

(1)

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：吸取上清50 μL使用Brandford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量(mg/mL)。

(2)

氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定：吸取上清1 mL使用甲醛法[17]測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量(g/100 mL)。

(3)

1.3.4 自溶液中葡聚糖水平測(cè)定

通過(guò)苯胺藍(lán)法[18]測(cè)定自溶液中葡聚糖水平。取1 mL自溶液12 000 r/min離心5 min，吸取上清液100 μL加入1 mL苯胺藍(lán)工作液，50 ℃暗反應(yīng)保溫30 min使熒光物質(zhì)形成，置于室溫30 min，徹底混勻，吸取180 μL至黑色96孔板進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm，測(cè)定反應(yīng)液熒光值。

1.3.5 自溶液中DPPH清除率測(cè)定

以DPPH清除率為指標(biāo)表征自溶液的抗氧化能力。采用分光光度計(jì)法，無(wú)水乙醇配制0.507 2 mmol/L DPPH自由基醇溶液后，取1 mL DPPH自由基醇溶液與1 mL自溶液混合，避光反應(yīng)30 min測(cè)定其OD517值。DPPH清除率計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：A0，DPPH溶液與無(wú)水乙醇混合后測(cè)定的OD517值；Ai，DPPH溶液與樣品反應(yīng)測(cè)得OD517值；Aj，無(wú)水乙醇與樣品混合反應(yīng)后測(cè)得OD517值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCIP平板初篩

啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母是3大食用酵母，被廣泛應(yīng)用于酵母自溶物的生產(chǎn)[2]，因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)這3種酵母進(jìn)行高溫敏感型突變菌的篩選。選擇用于商業(yè)生產(chǎn)的啤酒酵母pilsner、面包酵母AQ和葡萄酒酵母D254作為出發(fā)菌株。ARTP誘變方法能夠在大氣壓下產(chǎn)生等離子體射流從而導(dǎo)致基因突變，具有突變率高、易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株等特點(diǎn)，在誘變育種研究中被廣泛應(yīng)用[19]。誘變時(shí)間影響致死率，致死率過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致菌株性能大幅度改變，過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致誘變效率降低，一般選擇75%～85%的致死率。因此本實(shí)驗(yàn)選擇的誘變時(shí)間為45～46 s，此時(shí)致死率大約為80%(圖2)。

將誘變后的菌液涂布至BCIP平板進(jìn)行篩選，挑選短時(shí)間內(nèi)藍(lán)色較深的突變菌進(jìn)行后續(xù)測(cè)定，共得到16株啤酒酵母突變菌、14株面包酵母突變菌和12株葡萄酒酵母突變菌(圖3)。

2.2 突變菌的RNA溶出率

突變菌在37 ℃下自溶會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)如RNA、蛋白質(zhì)溶出，因此可通過(guò)自溶物中RNA的含量來(lái)快速判斷酵母自溶程度，以其相對(duì)原始菌自溶物的RNA含量表示，結(jié)果如表1所示。

大部分突變菌的自溶液RNA溶出率都高于原始菌，說(shuō)明BCIP平板篩選法能夠用于啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母的高溫敏感型突變菌的篩選，具有普適性。突變菌中P-510、A-14、D-12的自溶液RNA溶出含量最高，分別為各自原始菌自溶物RNA含量的239.51%、216.12%、216.80%。因此最終選擇P-510、A-14、D-12這3株高溫敏感型突變菌進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 高溫敏感型突變菌的性能考察

2.3.1 高溫下的生長(zhǎng)狀況和死亡率

為了進(jìn)一步分析突變菌在37 ℃的生理性能，測(cè)定了其在37 ℃的生長(zhǎng)狀況(圖4)和死亡率(圖5)。P-510、A-14、D-12均能在28 ℃正常生長(zhǎng)，但A-14的生長(zhǎng)略微弱于AQ。同時(shí)P-510、A-14、D-12均在37 ℃表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制。在37 ℃下培養(yǎng)12 h后，Pilsner、AQ和D254的死亡率變化不明顯，72 h后死亡率分別為4.2%、13.4%和2.5%，P-510、A-14和D-12的死亡率迅速增加，72 h后分別達(dá)到87.8%、79.00%和87.9%，說(shuō)明突變菌P-510、A-14和D-12對(duì)高溫敏感，不能在37 ℃下正常生長(zhǎng)。

2.3.2 突變菌的生長(zhǎng)曲線

誘變可能會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)能力造成影響，因此測(cè)定了突變菌的生長(zhǎng)曲線，如圖6所示。

3株突變菌和原始菌同時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，約6 h達(dá)到對(duì)數(shù)期中期。突變菌進(jìn)入平臺(tái)期后菌濃比原始菌略低，但菌株總體生長(zhǎng)一致，說(shuō)明經(jīng)過(guò)誘變處理后突變菌的生長(zhǎng)能力略微受到影響。

2.4 突變菌與原始菌的自溶物分析

2.4.1 突變菌自溶程度分析

核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮抽提率可用于衡量菌株的自溶程度。測(cè)定了原始菌和突變菌在37 ℃下的核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮抽提率(圖7)。

大部分菌株的RNA和蛋白質(zhì)的溶出在48 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，而氨基酸態(tài)氮的溶出在36 h到達(dá)峰值。對(duì)于核酸抽提率，自溶36 h后突變菌P-510、A-14、D-12相比于原始菌Pilsner、AQ、D254分別提高了2.7、1.8、1.7倍；對(duì)于蛋白質(zhì)抽提率，36 h后突變菌相比于原始菌分別提高了2.2、1.7、1.6倍；對(duì)于氨基酸態(tài)氮抽提率，36 h后突變菌相比于原始菌分別提高了1.3、1.2、1.2倍。其中P-510的核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮抽提率最高，分別能夠達(dá)到3.52%、0.32%和7.01%。綜上，在37 ℃下突變菌胞內(nèi)物質(zhì)的溶出率均高于原始菌，說(shuō)明突變菌的自溶程度高于原始菌，其中P-510的自溶程度最高。

2.4.2 突變菌與原始菌β-葡聚糖溶出差異

自溶過(guò)程中細(xì)胞壁受到壓力，多種水解酶作用于細(xì)胞壁，隨后細(xì)胞壁組分溶出，其中包括生物活性物質(zhì)β-葡聚糖[20]。β-葡聚糖的水平用相對(duì)熒光單位(relative fluorescent unit,RFU)表示，如圖8所示。P-510、A-14和D-12的β-葡聚糖溶出分別為5 332、5 157、4 851.5 RFU，比各自原始菌高出26.0%、10.3%和36.6%，說(shuō)明突變菌的高溫敏感性狀使其在37 ℃下自溶時(shí)溶出β-葡聚糖含量增加。β-葡聚糖是良好的生物活性物質(zhì)，并在食品、化妝品等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[21]。因此本實(shí)驗(yàn)篩選出的高溫敏感型突變菌能夠增加自溶物中β-葡聚糖的含量，具有在功能性食品中應(yīng)用的潛力。

2.4.3 不同溫度下自溶物抗氧化活性差異

酵母自溶物具有一定抗氧化性，主要是由于酵母自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解成活性肽，以及細(xì)胞壁組分溶出的葡聚糖和甘露聚糖等物質(zhì)具有抗氧化性[22]。P-510在37 ℃的自溶物DPPH清除率在60 h達(dá)到最高值，比Pilsner在50 ℃的自溶物DPPH清除率高出13.3% (圖9)。D-12在37 ℃的自溶物DPPH清除率也在60 h達(dá)到最高值，比D254在50 ℃的自溶物DPPH清除率高出6.8%。同時(shí)Pilsner和D254在50 ℃的自溶物DPPH清除率在84 h達(dá)到最高值，晚于其突變菌達(dá)到最高值的時(shí)間。與上述2株突變菌不同，A-14在37 ℃的自溶物DPPH清除率與AQ在50 ℃的自溶物DPPH清除率同時(shí)在84 h達(dá)到最高值，而前者比后者高出2.1%。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明與原始菌在50 ℃下自溶相比，突變菌在37 ℃下自溶能夠促進(jìn)活性物質(zhì)的溶出，且得到抗氧化活性更高的自溶物?？赡苁怯捎诘鞍酌复呋鞍踪|(zhì)中肽鍵水解時(shí)，溫度會(huì)影響多肽鏈的長(zhǎng)度、游離氨基酸的數(shù)量和氨基酸順序，從而影響自溶液的抗氧化性[13]。因此突變菌P-510、A-14和D-12在37 ℃自溶有利于獲得抗氧化活性較強(qiáng)的酵母自溶物。

3 結(jié)論

酵母自溶物具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性，特別是其具有的生物活性使酵母自溶物的研究逐漸受到關(guān)注。為提高酵母自溶物的活性物質(zhì)含量和抗氧化性，本研究以啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變，使用BCIP平板篩選獲得了3株高溫敏感型突變菌；突變菌在37 ℃下生長(zhǎng)受到抑制，37 ℃自溶時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)溶出增加，具有較好的自溶能力；突變菌自溶物中β-葡聚糖含量增加，且抗氧化活性提高。因此，篩選得到的菌株P(guān)-510、A-14和D-12具有功能性食品的應(yīng)用前景，在動(dòng)物飼料、化妝品、醫(yī)藥等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)酵母資源提供依據(jù)。但對(duì)于溫度影響酵母自溶物抗氧化性的具體原因還需要進(jìn)一步研究。