張強，代文婷，李冀新，金新文*

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊，830046) 2(新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子，832000)

甜瓜(Cucumismelo)是重要的葫蘆科經濟作物，新疆甜瓜品質好、含糖量高、風味優(yōu)良，深受消費者喜愛。甜瓜采收多集中于高溫的夏季，此時，果實不易長期貯藏與異地銷售，這嚴重影響了甜瓜產業(yè)的經濟效益，甜瓜采后貯藏保鮮的問題已成為制約甜瓜產業(yè)發(fā)展的重要瓶頸。

大多數甜瓜屬于呼吸躍變型水果，具有明顯的呼吸和乙烯釋放高峰，果實發(fā)生后熟即軟化加速并容易腐爛[1]。果實后熟軟化過程中，與果實品質相關的質地、色澤、糖酸組分、香氣及風味物質等評價指標也在發(fā)生變化[2-3]。糖類是果實的重要構成物質，并且糖代謝與果實的后熟軟化存在顯著的相關性[4-5]，在果實后熟軟化過程中，淀粉酶與蔗糖磷酸酶(sucrose phosphate synthase,SPS)對淀粉與可溶性糖之間的轉化起重要作用，使果實中淀粉與可溶性糖含量處于動態(tài)變化的平衡中[6-7]。淀粉對果實細胞結構起重要的支撐作用，是維持果實硬度的重要物質[8]，果實后熟軟化過程中淀粉不斷被水解，對果實細胞的支撐作用不斷減弱，果實的硬度也隨之下降[9]。

低溫貯藏能夠有效延緩果實后熟軟化，在低溫下，大量參與果實后熟生理代謝的酶活性、代謝中間物以及相關基因的表達均受到抑制，從而降低了果實中糖類及其他營養(yǎng)物質的消耗。乙烯是影響果實后熟生理過程至關重要的物質，乙烯對果實的糖代謝也存在顯著的相關性[10]。1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是常用的乙烯抑制劑，能夠競爭性地抑制乙烯后熟作用[11-12]。目前，對甜瓜果實后熟軟化與糖代謝及相關酶基因表達關系的研究鮮有報道。因此，本研究以甜瓜為研究對象，將甜瓜果實在常溫、1-MCP處理和低溫下貯藏，研究甜瓜果實后熟軟化過程中，淀粉、可溶性糖、關鍵酶活性及其基因表達的變化，探討糖代謝對甜瓜果實后熟軟化的影響，為改進與優(yōu)化甜瓜貯藏保鮮技術提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜瓜品種‘西州蜜17號’采自新疆石河子下野地，選取達到商品成熟度、重量、大小、無外傷、果型均勻的果實。1-甲基環(huán)丙烯，青島綠諾生物科技有限公司；DP 441 RNA提取試劑盒、KR 113反轉錄酶、KR 202 cDNA合成試劑盒、FP 209熒光定量檢測試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

AGY-1果實硬度測量計，溫州艾力儀器制造有限公司；3051H呼吸強度測定儀，杭州綠博儀器有限公司；Trace GC 1300氣相色譜儀、ABI 7500熒光定量PCR儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甜瓜果實處理

對照組為直接貯藏于(20±1) ℃常溫下的果實；1-MCP處理：將甜瓜果實用1 μL/L的1-MCP在20 ℃下熏蒸24 h后通風[13]，并于(20±1)℃下貯藏。冷藏處理：將果實置于(6±1)℃下預冷去除田間熱后在(2±0.5)℃下貯藏。每2 d對果實進行硬度、呼吸速率、乙烯釋放量、淀粉與可溶性糖代謝酶和基因表達等指標進行測定。

1.3.2 果實硬度和呼吸速率的測定

參照CAMPS等[14]與李明霞等[15]的方法，在果實縱切面，均勻選取4個點，測定果肉硬度，單位kg/cm2。

1.3.3 呼吸速率與乙烯釋放量的測定

呼吸速率：用氣流法測定，設定呼吸強度測定儀氣流速度為0.4 L/min，單位CO2mg/(kg·h)。

乙烯釋放量的測定：參照李江闊等[13]的方法，用氣相色譜儀測定，結果用μL/(kg·h)表示。

以上檢測每次取9個果實，分3組，每組3個果實，每組重復測3次。

1.3.4 果實可溶性糖和淀粉含量測定

參照謝季云等[16]的方法，略加修改，稱取2.0 g鮮樣果肉，研磨，加80%(體積分數)乙醇80 ℃水浴20 min，離心，集中上清液，重復3次，蒸去乙醇，加2 mL水溶解殘留物，微孔濾膜(0.25 μm)過濾，用液相色譜儀測定可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量。將上述提取可溶性糖的殘余物用高氯酸提取，用蒽酮比色法測定生成的葡萄糖含量，根據葡萄糖標準曲線計算淀粉含量，重復3次。

1.3.5 蔗糖代謝酶和淀粉酶活性測定

酶液提取和活性測定參照MERLO等[17]和ITAI等[18]的方法略加修改，稱取1.5 g鮮樣果肉，用液氮冷凍后研磨，加入6 mL提取液(50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L DTT，0.05% Tritonx-100和0.1% BSA)，勻漿后過濾，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，上清液于4 ℃下稀釋10倍后透析12 h，透析酶液用于酶活性測定。酶活性以OD520值表示。以失活酶液做空白對照，重復3次。

1.3.6 糖代謝關鍵酶基因的Real-time熒光定量PCR分析

總RNA提?。豪肦NA提取試劑盒提取果實總RNA，以總RNA為模板合成cDNA，Actin為內參基因，進行實時熒光定量PCR分析。

1.4 數據統(tǒng)計分析

用Excel軟件進行繪圖，用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，以P<0.05作為差異顯著的標準。

2 結果與分析

2.1 果實硬度的變化

如圖1所示，在20 ℃下，對照組甜瓜果實貯藏8 d后硬度迅速下降；1-MCP處理組果實在12～14 d硬度下降速度略快，與對照組相比，1-MCP處理組果實的后熟軟化進程較對照組有所推遲(P<0.05)；2 ℃下冷藏的甜瓜果實硬度下降最為緩慢，貯藏至第18天，果實硬度僅下降了2.7 kg/cm2。

2.2 甜瓜果實呼吸強度與乙烯釋放量的變化

呼吸強度是植物體新陳代謝的重要指標，與果實的成熟衰老密切相關。由圖2-a可知，20 ℃下果實呼吸速率迅速升高，第6天出現呼吸躍變峰；1-MCP處理呼吸躍發(fā)生在第12天，躍變峰值也顯著降低；2 ℃冷藏的果實則未出現呼吸躍變現象。乙烯具有促進果實成熟的作用，能夠加劇果實的后熟和衰老。如圖2-b所示，對照組與1-MCP處理組的乙烯釋放量均呈現先升高后降低的趨勢，對照組在第6天釋放量出現高峰，1-MCP處理組則推遲至第12天，且峰值較小。在2 ℃下冷藏的果實乙烯釋放量未出現顯著變化。結合圖2-a、b，可以看出，果實的呼吸強度與乙烯釋放量的變化存在密切的相關性與同步性。

2.3 果實淀粉和可溶性糖含量的變化

由圖3-a可知，在對照組中，甜瓜果實中的淀粉快速降解，淀粉含量下降較快；1-MCP處理能夠延緩淀粉降解，但長期貯藏后，淀粉含量下降幅度仍然較大；在2 ℃下，果實內淀粉降解被顯著抑制，淀粉下降緩慢，結合圖1分析可知，果實淀粉含量的下降與果實硬度的下降存在相同的變化趨勢。由圖3-b、c、d所示，對照組果實中可溶性糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)含量在貯藏初期有小幅增加，并在第6天達到最大值后開始下降，在1-MCP處理組果實的可溶性糖含量的變化幅度較對照組小，在貯藏后期呈下降趨勢，其中，葡萄糖含量下降的幅度較蔗糖與果糖大。而在2 ℃下，果實中可溶性糖的含量變化最小(P<0.05)，并能夠長期保持平穩(wěn)。

2.4 蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶(sucrosesynthase,SS)活性變化及其基因表達

從圖4-a、b可知，對照組與1-MCP處理組，甜瓜果實SPS活性及其基因表達均先升后降，1-MCP處理較對照組變化有所延遲，且變化量較小(P<0.05)；與對照組和1-MCP處理相比較，果實在2 ℃低溫下，SPS活性和SPS表達受到強烈抑制，酶活性與酶基因表達均處于較低水平(P<0.05)，這與蔗糖和果糖含量變化規(guī)律相一致(圖3-b、c、d)。

圖5-a、b表明，對照組中，甜瓜果實中SS活性不斷增強，SS基因表達則呈現先升高后緩慢下降的趨勢，說明基因表達小幅下降仍能維持酶的高活性。與對照組相比，1-MCP處理組中果實SS酶活性與SS的表達量均有所降低(P<0.05)，并且SS酶活性與SS基因表達的變化趨勢一致；與對照組和1-MCP處理組相比，在2 ℃下的果實中SS酶活性有所下降，并維持在低水平，SS的表達也受到顯著抑制(P<0.05)。

2.5 淀粉酶活性變化及其基因表達

由圖6-a、b結合圖1分析可知，對照組中，隨著甜瓜果實的后熟軟化，淀粉酶活性顯著升高，AM的表達量亦迅速增加。與對照組相比，1-MCP處理組果實的AM活性與AM基因表達受到一定程度的抑制，并有所降低(P<0.05)，但后期AM活性又有增加趨勢；3個組中，2 ℃下，果實AM活性與AM的表達所受抑制最為強烈，且始終穩(wěn)定在低水平。

2.6 酸性轉化酶(acid invertase,AI)活性變化及其基因表達

由圖7-a、b結果分析可知，與AM變化相似，對照組中果實酸性轉化酶活性隨著果實軟化迅速上升，并且發(fā)生呼吸躍變后呈加速上升趨勢，其基因表達也出現相似的規(guī)律；1-MCP處理使酶活性與基因表達的增加速度較常溫處理有所降低(P<0.05)，但同樣呈不斷上升的趨勢；同樣，與對照組和1-MCP處理相比，在2 ℃下，果實AI活性與AI基因表達受到強烈抑制，并顯著降低(P<0.05)。

3 討論

果實的后熟與軟化是一系列復雜生理生化反應作用的結果，糖類物質是果實的重要內含物質，糖代謝在這一過程中起重要作用[19-20]。

淀粉酶具有啟動果實軟化的作用，是果實軟化的關鍵酶[21]。研究表明，磨盤柿果實軟化主要由淀粉含量下降所致，柿果實在軟化前發(fā)生呼吸躍變，淀粉在淀粉酶的作用下產生的糖能夠為呼吸躍變提供所需的能源物質[22]。此外，在蘋果[23]、桃[24]、獼猴桃[25]、香蕉[26]和菠蘿蜜[27]等果實軟化過程中，均存在淀粉酶活性升高，淀粉大量降解，淀粉含量迅速下降的現象。本研究發(fā)現，甜瓜果實軟化過程中，淀粉酶活性與AM表達量增加最為顯著，在此過程中，淀粉含量迅速降低，果實硬度也快速下降，這表明淀粉降解是造成甜瓜果實軟化的重要原因。

在果實的軟化過程中，蔗糖含量也會發(fā)生顯著的變化，在香蕉、荔枝和獼猴桃果實的軟化階段，SPS活性顯著增加，蔗糖含量也快速上升，在果實軟化的后期，SPS活性開始降低，蔗糖含量也隨之下降[28-29]。

SPS和SS活性與甜瓜果實硬度的變化存在不同步性，SPS和SS酶活性與酶基因表達量變化趨勢一致，但酶活性與酶基因表達的增加要先于果實硬度的下降，這說明果實軟化是糖代謝積累到一定程度所產生的結果。此外，SPS和SS活性與酶基因表達均受1-MCP和低溫抑制，其變化分別與蔗糖和果糖含量變化趨勢一致。糖類物質多處于果實許多代謝的上游，為果實這些生理代謝提供底物和能量等[30]。本研究發(fā)現，對照組甜瓜果實中葡萄糖含量在貯藏初期存在短暫的上升，這可能是葡萄糖積累為啟動呼吸躍變提供能源物質的階段，在呼吸速率與乙烯釋放量發(fā)生躍變后葡萄糖含量又快速下降，這可能是由于果實發(fā)生躍變后，后熟軟化等一系列生理代謝迅速增加，需要大量的能源物質，消耗了大量葡萄糖，這也解釋了甜瓜果實軟化過程中，淀粉和其他糖不斷降解產生葡萄糖，而葡萄糖含量卻沒有顯著增加。在呼吸躍變后期，AI活性及其酶基因表達量亦顯著增加，由此可推斷，AI在甜瓜果實軟化的后期起作用。1-MCP處理組果實中各種糖含量的變化較對照組有所推遲，并且變化幅度較小，說明乙烯對糖代謝也具有促進作用，因此，抑制乙烯的生產，對延緩甜瓜果實糖代謝與后熟軟化有積極的作用。此外，低溫貯藏能夠更為有效地抑制甜瓜果實的呼吸代謝與乙烯的產生，并降低糖代謝酶活性及相關酶基因的表達量，大幅延緩甜瓜果實的后熟生理代謝進程。所以，在不發(fā)生冷害的情況下，適當低溫能夠抑制甜瓜果實的糖代謝，有效推遲果實的后熟軟化，從而延長甜瓜的貯藏保鮮期。