耿澤星， 單洪偉， 馬 甡， 左孝文， 王 騰

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)因其生長速度快、可高密度養(yǎng)殖，味道鮮美，且含有豐富的蛋白質(zhì)而在中國迅速推廣。凡納濱對蝦也是全球最主要的甲殼經(jīng)濟品種之一，占甲殼類動物總產(chǎn)量的53%，且其養(yǎng)殖規(guī)模及產(chǎn)量在逐年提高[1]。近年來，隨著人們對高產(chǎn)量的追求，凡納濱對蝦集約化程度不斷提高，引起養(yǎng)殖環(huán)境的日趨惡化，致使對蝦處于各種環(huán)境脅迫之中。環(huán)境脅迫往往會引起對蝦機體能量供應(yīng)和利用途徑的改變[2]。已有研究表明，鹽度的變化會改變凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)狀態(tài)，造成對蝦調(diào)節(jié)耗能的增加[3-4]，進而影響對蝦體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及其對營養(yǎng)物質(zhì)的需求[5]。

通過營養(yǎng)強化可以提高對蝦抗環(huán)境脅迫能力[6]。Palacios等研究發(fā)現(xiàn)，改善營養(yǎng)條件可以提高凡納濱對蝦仔蝦在低鹽度脅迫下的成活率[7]，然而，目前關(guān)于營養(yǎng)強化作用機制的研究較少。生物餌料是經(jīng)過篩選的優(yōu)質(zhì)餌料生物，其富含營養(yǎng)物質(zhì)以及多種活性物質(zhì)，對蝦攝食生物餌料后，能夠顯著提高對蝦免疫力和抗環(huán)境脅迫能力[8-10]。藻鉤蝦屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)端足目(Gammarid)鉤蝦亞目(Gammaridea)，多分布于溫帶和熱帶海域，并且具有廣鹽性，個體較大最大可長至28 mm，身體頭部前緣圓拱，體光滑且兩側(cè)較扁平，眼呈卵圓形，額角不明顯，側(cè)葉突出，藻鉤蝦大多棲息于潮間帶或潮下帶海藻[11]。藻鉤蝦是一種優(yōu)質(zhì)的生物餌料，飼喂藻鉤蝦不僅能夠提高對蝦養(yǎng)成過程中成活率，并且能顯著提高對蝦抗環(huán)境脅迫能力[12-13]。

在對蝦養(yǎng)殖過程中，由于降雨、換水或干旱等原因，養(yǎng)殖水體的鹽度會發(fā)生突變，從而影響對蝦的生長及成活率。本研究以凡納濱對蝦為研究對象，以低鹽度為脅迫因子，通過分析對蝦體內(nèi)生化指標及呼吸代謝和滲透壓調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶活性變化，探究飼料中添加鉤蝦粉對凡納濱對蝦低鹽度脅迫適應(yīng)性調(diào)節(jié)的影響。本研究結(jié)果將為生物餌料在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用及作用機制的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料的制備

配制3種等氮等能飼料，其中鉤蝦粉在飼料中比例分別為0%、8.25%和33%(記為D0、D8.25和D33)。飼料制備過程如下：飼料原料經(jīng)粉碎后過80目篩，采用逐級擴大法混合均勻，隨后添加魚油、卵磷脂，再添加水和氯化膽堿，混勻，壓制成粒徑為1.0 mm的顆粒飼料，于55 ℃烘干，自然冷卻后放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。配制成?種飼料配方及營養(yǎng)成分見表1，飼料中粗蛋白水平約為36.04%，總能約為16.79 MJ/kg。本實驗中所使用的鉤蝦粉制作過程如下：將藻鉤蝦(購買于山東省濰坊市昌邑縣王家莊子村，生長水域鹽度35)清洗干凈后使用冷凍干燥機進行凍干處理，粉碎后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗飼料配方(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition of the experimental diets(D.M. basis) /%

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 營養(yǎng)強化 營養(yǎng)強化在室內(nèi)水泥池(206 cm×137 cm×97 cm，水體積約為2.25 m3)中進行，每個水泥池放置(753±36)尾凡納濱對蝦(體長(5.32±0.69)cm，體重(1.80±0.72)g)，持續(xù)48 d，營養(yǎng)強化過程中，每天投喂4餐(6:00、10:00、18:00和22：00)，每餐投喂后查看殘餌情況，以便調(diào)整投喂量。

D0組、D8.25組和D33組分別投喂含鉤蝦粉為0%、8.25%和33%的實驗飼料。營養(yǎng)強化過程中，養(yǎng)殖水質(zhì)參數(shù)如下：DO>6 mg/L，水溫(24.7±3.5) ℃，鹽度30±0.5，pH 7.65～7.97。

1.2.2 低鹽度脅迫 營養(yǎng)強化結(jié)束后，對蝦停食24 h開始低鹽度脅迫實驗，脅迫鹽度為5，脅迫持續(xù)8 d。各組實驗用蝦規(guī)格見表2。低鹽度脅迫在泡沫箱中進行(66 cm ×35 cm×27 cm，水體積為50 L)，每個泡沫箱為一個平行，放置15尾對蝦。每個實驗組設(shè)置6個平行，其中3個用于取樣，3個用于記錄死亡率。

表2 各組鹽度脅迫實驗用蝦規(guī)格Table 2 The shrimp size used in salinity lstress in different groups

1.3 樣品的采集與分析

在低鹽度脅迫后的0、6、12、24、48、96和192 h取樣，隨機從各組中選取3尾對蝦，用針管從對蝦血竇處按血淋巴與抗凝劑(450 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2-EDTA，10 mmol/L HEPES，pH 7.3)[14]體積比為1∶3的比例抽血，抽出的血淋巴立即離心(4 000 r/min，10 min)，取上清置于-20℃冰箱內(nèi)保存待測。取對蝦肝胰腺、腮置于-20℃冰箱內(nèi)保存待測。

實驗測定的指標包括甘油三酯(TG)含量、總膽固醇(T-CHO)含量、蛋白質(zhì)(Protein)含量、葡萄糖(Glu)含量、乳酸(LD)、己糖激酶(HK)活性、果糖-6-磷酸激酶(PFK)活性、乳酸脫氫酶(LDH)活性、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性、Na+/K+-ATP酶活性，均使用試劑盒(南京建成)按照說明書完成測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用spss22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Tukey檢驗進行組間差異顯著性分析，顯著水平為0.05，實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 低鹽度脅迫階段對蝦累積死亡率

低鹽度脅迫對蝦累積死亡率如圖1所示。脅迫期間，D0組出現(xiàn)死亡的時間較D8.25組和D33早，在脅迫6 h出現(xiàn)了死亡，而D8.25組和D33組在12 h出現(xiàn)死亡。在脅迫192 h，D0組對蝦累積死亡率最高，達到60%，D8.25組和D33組對蝦累積死亡率均為23.33%。脅迫結(jié)束時，D8.25組和D33組對蝦的累積死亡率較D0組低61.11%。

圖1 低鹽度脅迫階段各組對蝦累計死亡率Fig.1 Cumulative mortality rate of shrimps in different groups at low-salinity stress period

2.2 對蝦血淋巴中生化物質(zhì)水平的變化

各組對蝦血淋巴中生化物質(zhì)水平變化如圖2所示。各組對蝦血淋巴中蛋白含量隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，在脅迫96～192 h，D0組下降更加明顯，顯著低于D8.25組和D33組(P<0.05)(見圖2(A))。D8.25組和D33組對蝦蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

各組對蝦血淋巴中葡萄糖含量整體呈現(xiàn)下降趨勢，下降速度與鉤蝦粉的添加量呈負相關(guān)(見圖2(B))。在脅迫0～12 h，D33組對蝦血淋巴中葡萄糖含量顯著低于D0組和D8.25組(P<0.05)。在脅迫24～192 h，D33組對蝦血淋巴中葡萄糖含量顯著高于D0組(P<0.05)。各組對蝦血淋巴中乳酸含量在脅迫6 h內(nèi)急劇下降，然后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，各組之間無明顯差異(見圖2(C))。

各組對蝦血淋巴中甘油三酯含量隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，且D0組下降更明顯(見圖2(D))。在脅迫0～12 h、48 h，D33組對蝦血淋巴中的甘油三酯含量顯著低于D0組(P<0.05)；在脅迫24 h、96～192 h，D33組與D0組對蝦血淋巴中的甘油三酯含量差異不顯著(P>0.05)；在脅迫6～24 h，D8.25組對蝦血淋巴中的甘油三酯含量顯著低于D0組(P<0.05)；在脅迫48～96 h，D8.25組對蝦血淋巴中的甘油三酯含量顯著高于D0組(P<0.05)。對蝦血淋巴中總膽固醇含量與對蝦血淋巴中甘油三酯含量變化趨勢類似(圖2(E))。

(同一時間點，不同字母表示處理組間存在顯著性差異(P<0.05)。At each time-point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

2.3 對蝦肝胰腺中生化物質(zhì)水平的變化

各組對蝦肝胰腺中生化物質(zhì)水平變化如圖3所示。各組對蝦肝胰腺中蛋白含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，且肝胰腺中蛋白質(zhì)含量為D33組>D8.25組>D0組(見圖3(A))。在脅迫6、12、48和96 h后，D33組對蝦肝胰腺中蛋白質(zhì)含量顯著高于D0組和D8.25組(P<0.05)。在脅迫6和48 h后，D8.25組對蝦肝胰腺中蛋白質(zhì)含量顯著高于D0組(P<0.05)。

各組對蝦肝胰腺中乳酸含量在脅迫6 h內(nèi)時急劇上升(見圖3(B))。在脅迫24 h后， D0組和D8.25組對蝦肝胰腺乳酸含量急劇下降且處于較低水平，而D33組對蝦肝胰腺乳酸含量依然處于較高水平，且顯著高于D0組和D8.25組(P<0.05)，而D8.25組對蝦肝胰腺中乳酸含量的變化趨勢與D0組類似且無顯著性差異(P>0.05)。

在脅迫0～12 h，D33組對蝦肝胰腺中甘油三酯含量顯著低于D0組(P<0.05)(見圖3(C))。然而，在脅迫24、48和192 h，D33組對蝦肝胰腺中甘油三酯含量與D0組無顯著性差異(P>0.05)。脅迫24～192 h，D8.25組對蝦肝胰腺中甘油三酯含量顯著高于D0組(P<0.05)。整體上，D33組對蝦肝胰腺中總膽固醇含量顯著低于D0組和D8.25組(P<0.05)(見圖3(D))。

2.4 對蝦肝胰腺中呼吸代謝關(guān)鍵酶的變化

各組對蝦肝胰腺中呼吸代謝關(guān)鍵酶的變化如圖4所示。各組對蝦肝胰腺中己糖激酶活性呈現(xiàn)出緩慢升高，然后再緩慢下降的趨勢(見圖4(A))。在脅迫0 和24 h，D33組對蝦肝胰腺中己糖激酶活性顯著高于D0組(P<0.05)。在脅迫12和48 h，D8.25組對蝦肝胰腺中己糖激酶活性顯著高于D0組(P<0.05)。

各組對蝦肝胰腺中磷酸果糖激酶活性隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(見圖4(B))。在脅迫前期，D8.25組和D33組上升更加明顯，在12 h達到峰值后維持在穩(wěn)定水平，而D0組在48 h達到峰值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。在脅迫96～192 h，D8.25組和D33組對蝦肝胰腺中磷酸果糖激酶活性顯著高于D0組(P<0.05)。

D8.25組和D33組對蝦肝胰腺中乳酸脫氫酶活性在6 h出現(xiàn)急劇上升，然后維持在較高水平，而D0組對蝦肝胰腺中乳酸脫氫酶活性一直處于較低水平(見圖4(C))。整體上，D8.25組和D33組對蝦肝胰腺中乳酸脫氫酶活性顯著高于D0組(P<0.05)，且D33組高于D8.25組。

各組對蝦肝胰腺中琥珀酸脫氫酶活性均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，但D0組、D8.25組和D33組之間差異不顯著(P>0.05)(見圖4(D))。

(同一時間點，不同字母表示處理組間存在顯著性差異(P<0.05)。At each time-point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

(同一時間點，不同字母表示處理組間存在顯著性差異(P<0.05)。At each time-point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

2.5 對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性變化

各組對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性變化如圖5所示。各組對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性在脅迫6 h內(nèi)急速上升，然后維持在一個較高的水平。然而，D0組、D8.25組和D33組對蝦之間無顯著性差異(P>0.05)。

(同一時間點，不同字母表示處理組間存在顯著性差異(P<0.05)。At each time-point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

3 討論

3.1 飼喂鉤蝦粉對對蝦抗低鹽度脅迫能力的影響

鉤蝦是一種優(yōu)質(zhì)的生物餌料，擁有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，已有研究證實飼喂鉤蝦可以提高對蝦抗環(huán)境脅迫能力[12-13]。本研究結(jié)果表明，飼喂鉤蝦粉可以顯著提高對蝦抗低鹽度脅迫能力，這可能與其對養(yǎng)殖對蝦的營養(yǎng)補充有關(guān)，已有研究表明，營養(yǎng)強化可以提高對蝦抗鹽度脅迫能力[7]。鉤蝦含有豐富的蝦青素以及其他類胡蘿卜素[15]，Yamada等[16]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加一定含量的蝦青素可以顯著提高對蝦存活率，蝦青素可以通過清除脅迫中產(chǎn)生的活性氧來減輕環(huán)境脅迫對對蝦產(chǎn)生的危害。Chien等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對蝦受到溫度脅迫、鹽度脅迫、缺氧脅迫或氨氮脅迫時，添加蝦青素都可以顯著提高對蝦的存活率，因此，飼喂鉤蝦粉提高對蝦抗低鹽度脅迫能力可能是與鉤蝦粉中富含蝦青素有關(guān)。

3.2 飼喂鉤蝦粉對對蝦體內(nèi)生化物質(zhì)水平的影響

本研究結(jié)果顯示，飼喂鉤蝦粉可以顯著提高對蝦血淋巴和肝胰腺中蛋白質(zhì)含量。對蝦血淋巴和肝胰腺中的蛋白質(zhì)作為重要的能量儲備物質(zhì)，在低鹽度脅迫時，會分解成氨基酸，一方面提供能量，另一方面提供游離氨基酸來調(diào)節(jié)滲透壓[19-20]。因此，飼喂鉤蝦組對蝦高水平的蛋白質(zhì)含量可以提供更多的游離氨基酸以及能量以應(yīng)對鹽度脅迫，這有利于對蝦鹽度耐受性的提高。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)各組對蝦在低鹽度脅迫下血淋巴和肝胰腺中蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)下降趨勢，進一步證實了在低鹽度脅迫下對蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化。鉤蝦富含蛋白質(zhì)，武云飛等研究了青海鉤蝦的營養(yǎng)作用，證明青海鉤蝦是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白源[21]，因此，飼喂鉤蝦粉提高對蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)含量與其蛋白質(zhì)的補充作用有關(guān)。

糖類是生物體內(nèi)的重要能源物質(zhì)，Welcomme等[22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲殼動物進入低鹽度環(huán)境時，其細胞線粒體數(shù)量會急劇上升，氧化代謝上升，耗能加大，同時血淋巴葡萄糖水平下降。本研究中，各組對蝦血糖含量除了在12 h時上升外均呈現(xiàn)下降的趨勢，說明對蝦為了應(yīng)對環(huán)境變化，可能通過增強糖代謝途徑來增強機體供能，而脅迫6～12 h對蝦血糖含量增加可能是因為當(dāng)血糖含量下降至一定程度時啟動糖再生作用，致使血糖含量上升。然而，伴隨著對蝦滲透壓調(diào)節(jié)耗能的增加，對蝦血糖含量總體呈現(xiàn)下降趨勢。此外，各組對蝦血糖濃度雖然均顯著降低，然而投喂鉤蝦粉的對蝦血糖濃度波動較小。對蝦在饑餓、營養(yǎng)過剩等條件下，機體精準地調(diào)控自身的平衡狀態(tài)，維持了復(fù)雜的生命活動正常進行[23]。因此，投喂鉤蝦粉能夠維持血淋巴內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而更好地維持低鹽度脅迫下機體的供能狀態(tài)。

乳酸是甲殼動物無氧代謝的最終產(chǎn)物，乳酸含量可以反映機體無氧代謝的強弱[24-25]。本研究中，在低鹽度脅迫1～6 h時，各組對蝦肝胰腺中乳酸濃度的增加說明對蝦的無氧代謝水平增強。脅迫12 h后，D0組和D8.25組肝胰腺中乳酸含量呈下降趨勢，而D33組對蝦肝胰腺乳酸含量依然處于較高水平。由此推測，相比于其它各組，D33組對蝦無氧代謝持續(xù)供能的能力更強。各組對蝦血淋巴中乳酸含量在6 h時急劇下降，然后趨于平穩(wěn)，這可能是血淋巴中的乳酸被轉(zhuǎn)移到肝胰腺中進行代謝的原因。

甘油三酯與總膽固醇的含量變化可以反映出機體脂類代謝水平，并且甘油三酯的含量能夠反映機體利用儲存脂肪的能力[26-27]，本實驗中發(fā)現(xiàn)，飼喂鉤蝦粉降低了對蝦血淋巴中甘油三酯和總膽固醇含量，表明飼喂鉤蝦粉影響了對蝦的脂肪代謝水平。已有研究表明，水產(chǎn)動物攝入食物的脂質(zhì)含量會影響機體脂質(zhì)的含量，機體脂質(zhì)含量與日糧脂質(zhì)水平呈正相關(guān)[28-29]。并且，蝦青素會減少生物體內(nèi)脂肪沉積[30]。因此，飼喂鉤蝦粉影響對蝦的脂肪代謝水平，可能是鉤蝦粉配合飼料中脂質(zhì)含量較低以及鉤蝦粉中富含蝦青素所引起的。

3.3 飼喂鉤蝦粉對對蝦肝胰腺中呼吸代謝酶的影響

己糖激酶和磷酸果糖激酶是糖酵解途徑中的兩種關(guān)鍵酶，其活性的變化對維持機體血糖水平以及糖酵解速率具有重要作用[31-33]。在脅迫0～12 h時，各組對蝦肝胰腺中己糖激酶活性以及磷酸果糖激酶活性的上升說明在脅迫前期對蝦肝胰腺中糖酵解水平增強，而在脅迫24 h之后，己糖激酶活性以及磷酸果糖激酶活性緩慢下降可能是因為對蝦適應(yīng)了環(huán)境變化，這與郭彪等發(fā)現(xiàn)溫度突變對對蝦糖酵解途徑關(guān)鍵酶的影響相似[34]。在無氧或者低氧環(huán)境下，糖酵解是對蝦獲取能量的主要方式之一[35-36]，低鹽度下凡納濱對蝦的耗氧率上升[37]，機體會出現(xiàn)供氧不足的情況[38]。因此，飼喂鉤蝦粉增強了凡納濱對蝦低鹽度脅迫下的糖酵解水平，這有利于對蝦更好地適應(yīng)低鹽脅迫。

乳酸脫氫酶是葡萄糖無氧代謝過程中的關(guān)鍵酶[39]，可以催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化[40]，其活性的大小可以在一定程度上反映機體無氧代謝水平的高低[41]。本研究中，飼喂鉤蝦粉的對蝦肝胰腺中乳酸脫氫酶活性在脅迫6 h急劇上升，在脅迫6 h之后緩慢下降，但顯著高于D0組。因此，以上研究結(jié)果表明飼喂鉤蝦粉可以增強對蝦低鹽度脅迫下無氧代謝水平，尤其在脅迫前期，從而為對蝦提供更多能量以應(yīng)對脅迫，這與糖酵解相關(guān)酶的研究結(jié)果一致。

琥珀酸脫氫酶是氧化磷酸化與電子傳遞之間的紐帶之一，其活性可以反映機體的有氧代謝水平[42]。本研究中，對蝦肝胰腺中琥珀酸脫氫酶活性呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，在192 h時達到最高，但是各組之間差異不顯著。以上研究結(jié)果表明，隨著脅迫時間的延長，對蝦肝胰腺中有氧代謝水平雖然不斷提高，但是有氧代謝水平的高低沒有顯著影響低鹽脅迫下對蝦的成活率。

3.4 對蝦鰓中離子轉(zhuǎn)運酶的變化

Na+/K+-ATP酶參與對蝦滲透壓的調(diào)節(jié)，在控制細胞體積、維持化學(xué)梯度方面起到重要作用[43]。許多研究已經(jīng)證明在低鹽度脅迫環(huán)境下，凡納濱對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性會顯著升高[44]。本研究中，各組對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性均在6 h內(nèi)急速上升，然后維持在一個較高的水平，但各組之間差異不顯著。對蝦從高滲環(huán)境中轉(zhuǎn)移到低滲環(huán)境中時，Na+/K+-ATP酶活性的急速上升可以有效的調(diào)節(jié)對蝦機體滲透壓，但本研究結(jié)果提示，Na+/K+-ATP酶的滲透調(diào)節(jié)作用不是影響低鹽脅迫下對蝦成活率的關(guān)鍵調(diào)控途徑。

4 結(jié)論

飼喂鉤蝦粉能夠顯著提高對蝦抗低鹽度脅迫能力，并且影響了對蝦機體代謝，具體表現(xiàn)為降低了脂肪代謝水平，而增強了無氧代謝水平。因此，飼喂鉤蝦粉對對蝦代謝的影響可能是其提高對蝦抗低鹽度脅迫能力的原因之一。