霍宇航，李檐堂，劉麗麗，張云云，魯周民*

（莫北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜莫 楊凌 712100）

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）為薔薇科枇杷屬常綠果樹，果實酸甜可口，深受人們喜愛，枇杷葉藥食兼用不僅是枇杷膏、利肺片[1]等藥品的原料，還被加工成枇杷葉茶、枇杷葉糖、枇杷葉飲料[2]等功能食品。枇杷葉毒性低[3]，具有抑咳[4]、降血糖、抗抑郁和抗腫瘤等藥理活性[5]，并對骨質(zhì)疏松[6]和慢性支氣管炎[7-8]等多種慢性病有防治功能。同時枇杷葉還具有美容和瘦身等功效[9-10]。多種藥理活性和其低毒的特性使枇杷葉茶[5]、枇杷葉和綠茶的混合茶[11]等枇杷葉產(chǎn)品成為非常有潛力的保健食品。有研究表明枇杷葉中富含的多酚類、黃酮類和三萜酸類是構(gòu)成枇杷葉保健作用、影響其本身及加工制品品質(zhì)的重要因素[12-13]。

枇杷葉作為原材料是影響其制品質(zhì)量的關(guān)鍵因素[14]，枇杷葉全年均可采回[15]，有研究表明新葉、成熟葉、老葉3 個成熟度的枇杷葉片黃酮、總?cè)扑?、總糖含量依次遞增[16-17]，不同品種枇杷葉中的總酚、黃酮、熊果酸、齊墩果酸含量存在差異[18-19]，不同采摘月份枇杷葉三萜酸類含量也存在差異[20]。對石榴葉在不同季節(jié)功能成分的研究表明，多酚類、黃酮類、生物堿類成分含量隨生長時間有一定變化趨勢[21]，對同一采回時期不同采集位點煙葉的研究也顯示存在代謝物的差異[22]。而關(guān)于不同品種和同一品種枝條上不同葉位枇杷葉的功能成分含量及變化規(guī)律鮮見報道。

本研究以總酚、沒食子酸、綠原酸、新綠原酸、黃酮、兒茶素、蘆丁、異槲皮苷以及總?cè)扑?、熊果酸、齊墩果酸和科羅索酸共12 種主要功能成分為指標(biāo)，對6 個品種枇杷樹樹冠外圍當(dāng)年同一時期生長的枝條上不同葉位的葉片進(jìn)行分析，比較不同品種、不同葉位的枇杷葉在主要功能成分含量上的差異，并揭示枇杷葉片功能成分隨葉位的變化規(guī)律，旨在為枇杷葉的相關(guān)研究和評價提供理論參考，并為枇杷葉功能成分在醫(yī)療保健和功能食品方面的應(yīng)用提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷品種為生長于莫北農(nóng)林科技大學(xué)發(fā)康北亞熱帶經(jīng)濟林果樹試驗示范站的‘長崎早生’、‘白茂木’、‘馬克’、‘佳伶’、‘大五星’和‘麥后黃’。葉片樣品于2017年12月18日采集后，立即運回實驗室進(jìn)行預(yù)處理。

沒食子酸（分析純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；福林-酚試劑 上海荔達(dá)生物科技有限公司；蘆丁（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；色譜純標(biāo)準(zhǔn)品熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸、綠原酸、蘆丁、新綠原酸、兒茶素、沒食子酸、異槲皮苷 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MULTISKAN GO型全波長酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo Fisher公司；1260高效液相色譜儀 美國發(fā)捷倫公司；KH-500DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；LS 220SCS型電子天平 瑞士普利賽斯公司；H1850型臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷葉采集與功能成分提取

枇杷葉采回方式為每個品種選擇同一年栽種的3 棵長勢一致的枇杷樹作為樣樹，在每棵樹的樹冠外圍選擇同一發(fā)芽時期生長的5 個枝條，自枝條頂端方下分別采集第1、3、5、7、9葉位的葉片，分裝標(biāo)記后運回實驗室。

清水洗凈葉片污漬，瀝干水分，剔除有病蟲危害的葉片，經(jīng)60 ℃烘箱烘干至恒定質(zhì)量，料理機粉碎，過60 目篩備用。準(zhǔn)確稱取1.000 g枇杷葉干粉并加入30 mL 50%乙醇溶液，在設(shè)定溫度30 ℃、功率100 W條件下超聲提取40 min，10 000×g離心10 min，取上清液，用酶標(biāo)儀測定總酚、黃酮、總?cè)扑岷?。每個處理重復(fù)3 次。

準(zhǔn)確稱取0.200 g枇杷葉干粉加入4 mL無水乙醇，浸提24 h后，在設(shè)定溫度30 ℃、功率100 W條件下超聲提取40 min，12 000×g離心15 min，取上清液，用高效液相色譜儀測定單體成分含量。每個處理重復(fù)3 次。

1.3.2 功能成分的測定

總（多）酚含量測定采用福林-酚試劑比色法。參考Hong Yanping等[18]的方法，并加以改進(jìn)。分別取0、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 7 個梯度質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液或適當(dāng)稀釋后的樣品液0.2 mL，置于加入1.5 mL水的試管中，加入0.5 mL福林-酚試劑和0.8 mL 7.5% NaCO3溶液，45 ℃水浴60 min，室溫靜置30 min后吸取200 μL反應(yīng)液于酶標(biāo)板上，以50%乙醇溶液為空白，于760 nm波長處測吸光度?？偡雍恳詻]食子酸計，單位為mg/g（以干質(zhì)量計，下同）。

黃酮含量測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法。參考Hong Yanping等[18]的方法，并加以改進(jìn)。分別取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 7 個梯度質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液或適當(dāng)稀釋后的樣品液0.2 mL于試管中，加入0.6 mL 5% NaNO2溶液混勻反應(yīng)5 min后，再加0.6 mL 10% Al(NO3)3溶液反應(yīng)6 min，最后加入1.8 mL 4% NaOH溶液，靜置15 min并吸取200 μL反應(yīng)液于酶標(biāo)板上，以標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液自身為空白，于波長510 nm處測吸光度。黃酮含量以蘆丁計，單位為mg/g。

總?cè)扑岷繙y定采用香草醛-高氯酸顯色法。參考張爽等[23]的方法，并加以改進(jìn)。取50 μL的上清液或梯度量（0、100、200、300、400、500、600 μL）熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，90 ℃水浴揮發(fā)溶劑，60 ℃烘箱烘干試管，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、0.6 mL高氯酸60 ℃水浴反應(yīng)15 min，冷水冷卻加2.2 mL冰醋酸后吸取200 μL反應(yīng)液于酶標(biāo)板上，以50%乙醇溶液為空白，于波長548 nm處測吸光度?？?cè)扑岷恳孕芄嵊嫞瑔挝粸閙g/g。

沒食子酸、兒茶素、綠原酸、新綠原酸、蘆丁、異槲皮苷含量測定參考張麗賢[24]、Ferreres[25]等的方法，并加以改進(jìn)。高效液相色譜測定條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相由去離子水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）、5%冰乙酸溶液（D）組成，洗脫體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長設(shè)定：沒食子酸和兒茶素在波長275 nm，綠原酸和新綠原酸在波長330 nm，蘆丁和異槲皮苷在波長360 nm；柱溫25 ℃。具體的流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜法的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for the HPLC method

熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸含量測定參考Zheng Meiyu等[26]的方法并加以改善。高效液相色譜測定條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相由0.001%冰乙酸溶液（A）和甲醇（B）組成，采用等度洗脫0～27 min，10% A，90% B；洗脫體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量2.5 μL；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸、多因素方差分析和主成分分析，并利用Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷葉主要功能成分隨葉位的變化

總酚含量在‘大五星’、‘馬克’和‘佳伶’3 個品種枇杷葉中隨葉位的增加呈快速上升趨勢，而在其余3 個品種中的變化不明顯（圖1A）；沒食子酸含量在6 個品種枇杷葉中隨葉位的增加總體呈上升趨勢（圖1B），而新綠原酸和綠原酸含量隨葉位的增加總體呈下降趨勢（圖1C、D）。其中，‘馬克’枇杷葉總酚含量隨葉位變化趨勢最為明顯，第9葉位葉片總酚含量（55.86 mg/g）比第1葉位葉片增加4.51 倍；‘麥后黃’枇杷葉沒食子酸含量隨葉位的變化趨勢較為明顯，第9葉位枇杷葉沒食子酸（9.54 mg/100 g）含量比第1葉位增加1.47 倍；‘大五星’枇杷葉新綠原酸、綠原酸含量隨葉位變化趨勢較為明顯，第1葉位枇杷葉新綠原酸（385.47 mg/100 g）、綠原酸（265.79 mg/100 g）含量比第9葉位分別增加7.50 倍和2.65 倍。

圖1 枇杷葉酚酸類成分含量隨葉位變化Fig. 1 Variations in phenolic acid contents in loquat leaves from different cultivars with leaf position

圖2 枇杷葉黃酮類成分含量隨葉位變化Fig. 2 Variations in fl avonoid contents in loquat leaves from different cultivars with leaf position

黃酮含量在‘大五星’、‘馬克’和‘佳伶’3 個品種枇杷葉中隨葉位增加呈上升趨勢，而在其余3 個品種中的變化不明顯（圖2A）；兒茶素含量在‘馬克’和‘佳伶’枇杷葉中隨葉位的增加而上升（圖2B）；蘆丁含量在‘大五星’、‘白茂木’、‘麥后黃’和‘長崎早生’4 個品種枇杷葉中隨葉位的增加總體呈下降趨勢（圖2C）；異槲皮苷含量在‘大五星’和‘麥后黃’枇杷葉中隨葉位的增加呈下降趨勢（圖2D）。其中，‘馬克’枇杷葉黃酮、兒茶素含量隨葉位變化趨勢最為明顯，第9葉位葉片黃酮（151.93 mg/g）、兒茶素（117.27 mg/100 g）含量比第1葉位葉片分別增加4.90 倍和10.75 倍 ；‘大五星’枇杷葉蘆丁、異槲皮苷含量隨葉位變化趨勢較為明顯，第1葉位枇杷葉蘆?。?.68 mg/100 g）、異槲皮苷（8.08 mg/100 g）含量比第9葉位分別增加1.39 倍和1.59 倍。

圖3 枇杷葉三萜酸類成分含量隨葉位變化Fig. 3 Variations in triterpenoid acid contents in loquat leaves from different cultivars with leaf position

總?cè)扑岷吭凇笪逍恰?、‘馬克’和‘佳伶’3 個品種枇杷葉中隨葉位增加呈上升趨勢，而在其余3 個品種中的變化不明顯（圖3A）；熊果酸含量在‘馬克’、‘佳伶’、‘白茂木’和‘長崎早生’4 個品種枇杷葉中隨葉位的增加總體呈上升趨勢（圖3B）；齊墩果酸含量在‘馬克’、‘佳伶’、‘白茂木’、‘麥后黃’和‘長崎早生’5 個品種枇杷葉中隨葉位的增加總體呈上升趨勢（圖3C）；科羅索酸含量在6 個品種枇杷葉中均隨葉位的增加總體呈上升趨勢（圖3D）。其中，‘馬克’枇杷葉總?cè)扑岷吭谌~位間差異最大，第9葉位葉片總?cè)扑幔?3.26 mg/g）含量比第1葉位葉片增加4.54 倍；‘白茂木’枇杷葉熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸含量隨葉位變化趨勢最為明顯，第9葉位枇杷葉熊果酸（18.38 mg/g）、齊墩果酸（3.16 mg/g）、科羅索酸（8.54 mg/g）含量比第1葉位分別增加45.41%、48.36%和2.40 倍。

12 種功能成分在每個枇杷品種不同葉位葉片中的含量不同，不同成分在6 個品種不同葉位葉片間含量的變化趨勢存在差異。

2.2 枇杷葉主要功能成分和葉位回歸分析

表2 枇杷葉主要功能成分含量和葉位回歸分析Table 2 Regression equations of the main functional components of loquat leaves versus leaf position

由2.1節(jié)分析可知，枇杷葉主要功能成分含量隨葉位的增加呈現(xiàn)一定變化規(guī)律，因此通過回歸分析法[27]以葉位值X為自變量，功能成分含量Y為因變量進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。12 種功能成分中，由于兒茶素含量在不同品種枇杷葉中隨葉位的變化趨勢差異較大，因此表現(xiàn)出與葉位值關(guān)系不明顯，另外11 種主要功能成分含量均與葉位值存在極顯著線性相關(guān)（P＜0.01）。其中，總酚、黃酮、總?cè)扑?、熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸和沒食子酸含量與葉位值呈正相關(guān)，新綠原酸、綠原酸、蘆丁和異槲皮苷含量與葉位值呈負(fù)相關(guān)。

科羅索酸、新綠原酸含量與葉位值相關(guān)系數(shù)較大，均在0.8以上，回歸方程的決定系數(shù)較高，表明葉位對枇杷葉片科羅索酸和新綠原酸含量影響較大，且在不同品種中隨葉位的變化較為一致。熊果酸和異槲皮苷含量與葉位值相關(guān)系數(shù)較低，決定系數(shù)過小，表明葉位對熊果酸和異槲皮苷含量的影響較小或存在品種差異。

2.3 枇杷葉主要功能成分比較

表3 枇杷葉主要功能成分比較Table 3 Comparison of the contents of the main functional components in loquat leaves from different varieties

如表3所示，總酚、黃酮、總?cè)扑帷⑿芄?、齊墩果酸、兒茶素、新綠原酸和異槲皮苷在不同品種枇杷葉中含量范圍分別為12.89～30.78、31.43～85.17、13.54～30.37、12.29～16.88、2.12～2.84 mg/g，22.33～274.44、106.71～243.59 mg/100 g和1.43～4.75 mg/100 g，在‘大五星’枇杷葉中含量最高，顯著高于其他5 個品種（P＜0.05）?？屏_索酸和沒食子酸在不同品種枇杷葉中含量范圍分別為3.69～5.44 mg/g和4.21～6.85 mg/100 g，在‘麥后黃’枇杷葉中含量最高，顯著高于其他5 個品種（P＜0.05）。綠原酸和蘆丁在不同品種枇杷葉中含量范圍分別為87.23～185.72 mg/100 g和1.09～3.70 mg/100 g，在‘白茂木’枇杷葉中含量最高，顯著高于其他5 個品種（P＜0.05）。

2.4 枇杷葉主要功能成分主成分分析

表4 主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues of first three principal components and their contribution rates to the total variance

對所測30 個樣本12 個主要功能成分進(jìn)行主成分分析，按特征值大于1.0的原則[28]所得相關(guān)矩陣的特征值和方差貢獻(xiàn)率見表4。提取的3 個主成分累計貢獻(xiàn)率為84.786%，可代表原始數(shù)據(jù)的大部分信息。其因子負(fù)荷矩陣和旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣見表5。

表5 因子負(fù)荷矩陣Table 5 Loading matrix of first three principal components

主成分的載荷矩陣旋轉(zhuǎn)之后載荷系數(shù)更接近1或者0，得到的主成分能夠更好地解釋變量[29]。旋轉(zhuǎn)后第1主成分主要受新綠原酸、綠原酸的正方影響；第2主成分主要受熊果酸、齊墩果酸、兒茶素的正方影響；第3主成分主要受總酚、黃酮、總?cè)扑岬恼接绊憽?/p>

表6 枇杷葉綜合得分排名Table 6 Comprehensive score ranking of loquat leaves from different varieties

將原始變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化消除不同單位和數(shù)據(jù)量綱的影響后[30]，參考萬紅兵等[31]主成分得分和綜合評價函數(shù)，對不同品種枇杷葉進(jìn)行各主成分得分和綜合得分的排名，結(jié)果見表6?！笪逍恰凌巳~3 個主成分得分和綜合得分均排名第1，‘麥后黃’和‘白茂木’2 個品種枇杷葉第1、2主成分得分和綜合得分排名靠前，‘馬克’和‘佳伶’2 個品種枇杷葉第3主成分得分排名靠前，這一結(jié)果與2.3節(jié)各品種主要功能成分比較結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

同一采回期內(nèi)，枇杷葉主要功能成分隨葉位增加有一定變化，其變化趨勢與品種有關(guān)?！笪逍恰?、‘馬克’、‘佳伶’3 個品種枇杷葉總酚、黃酮、總?cè)扑岷侩S葉位的增加而上升，而在‘白茂木’、‘麥后黃’、‘長崎早生’3 個品種枇杷葉中此變化不明顯。這可能與不同品種枇杷葉遺傳物質(zhì)的差異以及枇杷葉內(nèi)功能成分生物合成和代謝機理有關(guān)。本研究只涉及一個時期枇杷葉主要功能成分隨葉位的變化，對于不同季節(jié)枇杷葉功能成分含量以及與葉位間的變化規(guī)律，還有待進(jìn)一步深入研究。

本實驗研究的功能成分中，有11 種成分含量與葉位值存在顯著的線性相關(guān)性，其中，7 種成分呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系、4 種成分呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此利用葉位可以對枇杷葉功能成分含量做出評價。通過對6 個品種枇杷葉主要功能成分的比較和綜合評價，結(jié)果表明‘大五星’枇杷葉8 個主要功能成分含量顯著高于其他5 個品種，綜合評價居于首位，適合功能成分的綜合利用；‘白茂木’更適合于以綠原酸和蘆丁為主要成分的開發(fā)利用，‘麥后黃’更適合于以科羅索酸和沒食子酸為主要成分的開發(fā)利用。在枇杷葉的利用中應(yīng)考慮品種以及葉位的影響，并根據(jù)實際應(yīng)用需求選擇適合的品種并規(guī)范相關(guān)采回標(biāo)準(zhǔn)。