王琪，張浩，王博文，雷秀娟，王英平,※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118）

基因編輯技術(shù)是近幾年蓬勃發(fā)展的一項(xiàng)新型生物技術(shù)，不同于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的隨機(jī)性與不確定性，該技術(shù)能對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾。在特定位置斷裂核酸分子后，基于細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制，以非同源末端修復(fù)和同源重組途徑實(shí)現(xiàn)堿基的缺失、替換，基因的敲除、敲入等進(jìn)而達(dá)到對(duì)基因的編輯目的[1]。基因編輯技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)已廣泛應(yīng)用于各類基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)應(yīng)用，如基因組功能研究、動(dòng)植物育種、基因治療和遺傳性狀改良等領(lǐng)域且成果顯著。目前基因編輯技術(shù)已在模式植物和農(nóng)作物中發(fā)揮了巨大的作用，體系日漸成熟和完善，但藥用植物道地性強(qiáng)、數(shù)量相對(duì)稀少和研究范圍較窄的現(xiàn)狀在一定程度上制約了基因編輯技術(shù)在藥用植物領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展[2]。藥用植物基因編輯體系的建立必定是一個(gè)較為漫長(zhǎng)且艱難的歷程。

人參是藥用植物家族中的重要一員，被譽(yù)為“百草之王”，喜陰涼濕潤(rùn)的環(huán)境，主要分布在我國(guó)東北三省，同時(shí)也在朝鮮北部、日本中北部和韓國(guó)中部等臨近中國(guó)的山區(qū)地帶有所分布[3]。人參具有補(bǔ)氣安神、益肺益智、大補(bǔ)元?dú)夂脱a(bǔ)脾生津等功效[4]，除了因極具藥用價(jià)值而得到醫(yī)學(xué)藥學(xué)界的認(rèn)可外，人參還被應(yīng)用于保健和藥妝等領(lǐng)域。但目前仍有許多因素限制著人參產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，如人參道地性強(qiáng)，對(duì)生存環(huán)境要求嚴(yán)格；生長(zhǎng)年限長(zhǎng)，易遭受病蟲害；主要有效成分人參皂苷在植物本體內(nèi)的含量并不高且難以達(dá)到大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化等。隨著分子生物學(xué)手段的不斷更新和完善，越來(lái)越多的研究人員致力于從基因?qū)用鎸?duì)物種進(jìn)行直接調(diào)控。雖然目前對(duì)人參基因組的研究不夠全面和深入，但基因編輯技術(shù)可以推進(jìn)藥用植物基因組的功能研究，反之人參基因功能研究的完善也會(huì)加快基因編輯技術(shù)在人參中的發(fā)展。建立起人參基因編輯的相關(guān)體系，將對(duì)人參的遺傳分析、種質(zhì)創(chuàng)新和品質(zhì)改良具有重大意義。

1 基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)的發(fā)展主要經(jīng)歷了人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶（TALEN）技術(shù)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）技術(shù)。它們能特異性地識(shí)別靶位點(diǎn)，對(duì)其單鏈或雙鏈進(jìn)行精準(zhǔn)切割造成鏈的斷裂，啟動(dòng)生物體的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制來(lái)完成對(duì)靶標(biāo)基因的敲除乃至替換。尤其是CRISPR/Cas 系統(tǒng)以其靈活的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、低成本和短周期迅速引領(lǐng)了基因編輯的潮流，同時(shí)科研人員進(jìn)行了大量基于CRISPR/Cas9 的技術(shù)優(yōu)化以期實(shí)現(xiàn)更高效的基因編輯。

1.1 鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)

鋅指蛋白是1983 年在非洲爪蟾的TFA 家族中發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子。每個(gè)鋅指蛋白可以特異性地識(shí)別DNA 鏈上的3 個(gè)連續(xù)堿基，把3～6 個(gè)鋅指蛋白串聯(lián)成結(jié)構(gòu)域，便可識(shí)別更多的堿基及序列[5]，且具有較高的特異性。FokI 是在海床黃桿菌中發(fā)現(xiàn)的一類限制性內(nèi)切酶，只有在形成二聚體的前提下才能發(fā)揮其切割作用。1996 年，Kim 和Cha 兩位科學(xué)家將鋅指結(jié)構(gòu)與FokI 的酶解中心串聯(lián)起來(lái)，得到了鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[6]，經(jīng)人工改造后能夠?qū)崿F(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯。把鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和不同的酶、轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合就能形成具有特異性功能的蛋白復(fù)合體，發(fā)揮不同的作用。目前已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用的有鋅指核酸甲基化酶（ZFM）、鋅指激活因子（ZFA）、鋅指抑制因子（ZFR）以及鋅指核酸酶（ZFN）等[7]。ZFN 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。Osakabe 等[8]用鋅指核酸酶對(duì)擬南芥ABI4 基因進(jìn)行編輯，所獲得的純和植株對(duì)葡萄糖、脫落酸的敏感度降低；Li 等[9]通過(guò)ZFN 對(duì)B型小鼠進(jìn)行基因編輯治愈了血友病并獲得具遺傳性狀的個(gè)體；Cai 等[10]利用ZFN 對(duì)煙草CHN50 基因進(jìn)行編輯，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的同源重組修復(fù)途徑，成功將外源基因PAT 整合到靶序列中。

1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶（TALENs）技術(shù)

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（transcription activator-like effector,TALE）是在植物病原菌黃單胞菌屬（Xanthomonas）中首先被發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)保守的菌體蛋白[8]，由其T3S（type secretion system）分泌，侵染細(xì)胞后可以特異性地識(shí)別植物的DNA 序列[11]，模擬宿主行為激活靶基因的轉(zhuǎn)錄并從基因?qū)用鎸?duì)植株進(jìn)行調(diào)控。TALE 蛋白DNA 結(jié)構(gòu)域第12 和13 位的氨基酸協(xié)同作用組成一個(gè)識(shí)別單元（repeat variable diresidues，RVD），每個(gè)RVD能特異性識(shí)別某種堿基[12]。研究人員把TALE 的識(shí)別結(jié)合域和FokI 的DNA 切割域相互融合，成功構(gòu)造出能識(shí)別并切割DNA 雙鏈的特異性核酸內(nèi)切酶（TALENs）。TALENs 在植物育種、基因治療和遺傳改良等領(lǐng)域皆取得了顯著成效。Shan 等[13]通過(guò)該技術(shù)對(duì)控制水稻香味的OsBADH2 基因進(jìn)行敲除獲得了香味株系并在此基礎(chǔ)上成功培育了香稻品種；Bacman 等[14]利用TALENs 成功實(shí)現(xiàn)線粒體的基因編輯，為線粒體病的基因治療開辟了新途徑；Haun 等[15]對(duì)調(diào)控大豆脂肪酸的FAD2-1a、FAD2-1b基因進(jìn)行敲除，去脂肪酸飽和酶表達(dá)量大幅減少，大豆飽和油含量增高，延長(zhǎng)了大豆的保存時(shí)間。

1.3 歸巢核酸酶技術(shù)

歸巢核酸酶是一種稀有的大范圍核酸內(nèi)切酶，能夠識(shí)別其他內(nèi)切酶所不及的長(zhǎng)DNA 序列，特異性識(shí)別的切割位點(diǎn)也較大（通常大于14 bp），因此脫靶效率極低。但是天然存在的歸巢核酸酶的位點(diǎn)極少，可利用率和突變率不高。且該酶只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，DNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生的微小改變就可能導(dǎo)致切割失敗。歸巢核酸酶的設(shè)計(jì)難度很大，對(duì)技術(shù)要求嚴(yán)苛，不宜進(jìn)行人工改造，因而該技術(shù)難以在基因編輯領(lǐng)域廣泛使用[16]。由于歸巢核酸酶的高特異性，在人類基因組中發(fā)生解理的頻率低，可以作為具有高針對(duì)性的分子剪刀靶向于特定的基因達(dá)到基因治療的目的。Redondo 等[17]設(shè)計(jì)改造的歸巢核酸內(nèi)切酶有可能修復(fù)在“著色性干皮膚”中發(fā)生突變的基因。

1.4 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）技術(shù)

CRISPR即規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）。1987 年Ishino 等[18]首次在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)該重復(fù)序列；2005 年，CPISPR 技術(shù)的研究有了重大進(jìn)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)被侵染細(xì)菌的CRISPR 中，其間隔序列和入侵它們的病毒噬菌體部分核酸鏈有著高度同源性，進(jìn)而推測(cè)CPISPR 與細(xì)菌免疫存在必然聯(lián)系[19]。2007 年，Barrangou 等[20]發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌以CRISPR/Cas系統(tǒng)成功抵抗噬菌體的入侵。噬菌體首次侵入細(xì)菌時(shí)，其序列片段會(huì)被Cas 蛋白編碼的酶切割下來(lái)并整合到CRISPR 的重復(fù)序列間，賦予細(xì)菌獲得性免疫的功能，如果同一噬菌體再次入侵便能被細(xì)菌識(shí)別并直接切割，至此基于CPISPR的免疫機(jī)制更加明確。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物所特有的用來(lái)抵抗病毒感染的免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)的基因座包括3個(gè)部分，5'端的tracrRNA 基因、中間的Cas 蛋白編碼區(qū)以及3'端的CRISPR 基因座。II 型系統(tǒng)存在于大多數(shù)細(xì)菌中，是在Cas9 蛋白存在的前提下引起細(xì)胞免疫降解噬菌體或外源DNA，結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，便于改造利用，只需要人工合成一條gRNA即可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，因此備受青睞。劉婷婷等[21]對(duì)毛白楊中的內(nèi)源基因八氫番茄紅素脫氫酶進(jìn)行敲除，獲得多個(gè)突變體株系；胡春華等[22]針對(duì)香蕉的MaPDS 基因成功構(gòu)建了MaPDS 編輯載體，以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功轉(zhuǎn)入植物體并經(jīng)一系列篩選培養(yǎng)最終獲得具抗性的獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系；禹明森等[23]根據(jù)生菜FANCM 基因建立了生菜的CRISPR/Cas9 基因編輯體系，為培育更具優(yōu)勢(shì)性狀的新品種奠定了基礎(chǔ)；周巖等[24]基于CRISPR 以基因槍轉(zhuǎn)化法對(duì)非香型粳稻品種“吉粳88”進(jìn)行基因編輯并成功獲得純合的子一代；奉寶兵等[25]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)脫支酶基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯獲得了等位變異的遺傳材料；王金彪等[26]通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對(duì)甘藍(lán)型油菜的BnaLCR78基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)敲除，為后續(xù)的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

基因編輯效率受載體類型、材料狀態(tài)和轉(zhuǎn)化體系等多種綜合因素的影響，編輯效率偏低和容易脫靶等仍是編輯過(guò)程中的難題。在原有基礎(chǔ)上對(duì)基因編輯的體系進(jìn)行優(yōu)化是主要任務(wù)之一。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)sgRNA 3'端第20 位堿基為G 或第16 位堿基為C 時(shí)編輯效率相對(duì)較高[27]，但這些結(jié)論往往是經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)和數(shù)據(jù)歸納得到，具體作用機(jī)制并不明確，因此要得到特異性高的sgRNA不僅需要理論知識(shí)的鋪墊，還要進(jìn)行大量重復(fù)試驗(yàn)才能優(yōu)中選優(yōu)。一種氨基酸可由多個(gè)密碼子編碼，但環(huán)境、遺傳和進(jìn)化等多因素影響讓不同物種有各自的密碼子偏好性，sgRNA與物種的密碼子偏好性一致可能會(huì)提高基因編輯的效率，如果根據(jù)物種的偏好性對(duì)Cas9 的蛋白進(jìn)行改造優(yōu)化，Cas9 在生物體內(nèi)的表達(dá)活性可能較高。例如，禾本科植物基因組中G 和C含量較高，可以據(jù)此提高Cas9 蛋白密碼子的C 和G含量去適應(yīng)該物種的密碼子偏好性；以人類基因密碼子優(yōu)化的Cas9 在水稻中表達(dá)量和突變率都很低，而基于水稻密碼子優(yōu)化的Cas9 蛋白靶向同一序列，突變效率顯著提高；同一啟動(dòng)子在不同物種或不同啟動(dòng)子在同一物種內(nèi)的表達(dá)效率皆有所差異，在選擇啟動(dòng)子時(shí)可以借鑒其他物種編輯成功的案例。基因編輯體系初步建立時(shí)，可以同期構(gòu)建不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最適合該物種的啟動(dòng)子；也可以通過(guò)啟動(dòng)子的串聯(lián)，增加啟動(dòng)子個(gè)數(shù)以增加驅(qū)動(dòng)能力，提高表達(dá)效率。未經(jīng)改造的野生型Cas9 蛋白能切割雙鏈DNA形成DSB，人為地將Cas9 蛋白的某個(gè)結(jié)構(gòu)域失活使其成為Cas9 nickase（nCas9），該蛋白就只具有單鏈切割活性產(chǎn)生SSB（single-strand breaks），此時(shí)細(xì)胞會(huì)以高保真的堿基切除方式進(jìn)行修復(fù)，也可以降低脫靶效率[28]。如果將2 個(gè)結(jié)構(gòu)域都失活形成Dead Cas9（dCas9），Cas9 將不具有核酸酶活性，但仍可以在gRNA 引導(dǎo)下與靶序列結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)；Cpf1 是單鏈crRNA 介導(dǎo)的一種核酸內(nèi)切酶，Cas9 更具優(yōu)勢(shì)：Cpf1 分子量小，更容易被導(dǎo)入細(xì)胞，Cas9在兩條鏈的相同位置進(jìn)行切割產(chǎn)生平末端，有利于細(xì)胞啟動(dòng)NHEJ 修復(fù)途徑。而Cpf1 在雙鏈的不同位置進(jìn)行切割產(chǎn)生黏性末端，有利于細(xì)胞啟動(dòng)HR 修復(fù)途徑，更適用于基因敲入。Cas9 的切割位點(diǎn)臨近PAM序列，但Cpf1 切割位點(diǎn)距離識(shí)別的序列較遠(yuǎn)，擴(kuò)大了靶基因的范圍，編輯位點(diǎn)多樣性增加。Cpf1脫靶效率低，且具有雙重活性，能切割DNA 和RNA[29]。

2 基因編輯技術(shù)在人參中的應(yīng)用

2.1 推進(jìn)人參基因組學(xué)研究

研究物種的基因組是分子生物學(xué)的重要任務(wù)之一，對(duì)基因組結(jié)構(gòu)、定位和功能的分析能揭示物種生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律，從根本上探尋不同個(gè)體間的差異和共性。研究基因功能的方法有很多種，如基因敲除、基因克隆、反義RNA 和RNAi 等。陳超等[30]從人參葉片中克隆了PgAGO1 基因并進(jìn)行生信分析，提取人參不同部位的RNA，通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)所克隆的基因在人參不同部位的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因在人參花中的表達(dá)量高，在根中的表達(dá)量較低，為PgAGO1 基因在人參基因組中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。梁彥龍等[31]基于反義RNA 技術(shù)構(gòu)建了人參環(huán)阿屯醇合酶（CAS）基因的反義表達(dá)載體，抑制了甾醇的合成途徑，使前體物質(zhì)氧化角鯊烯更多地流向皂苷合成，獲得了皂苷含量相對(duì)較高而甾醇含量較低的發(fā)根系，明確了CAS基因在人參代謝中的途徑以及該基因在人參皂苷合成中的調(diào)控作用。曹豪杰等[32]利用RNAi 技術(shù)干擾-香樹素合酶（ -AS）基因的表達(dá)，以期抑制齊墩果烷型皂苷（Ro）的代謝通路，使更多的前體物質(zhì)流向合成達(dá)瑪烷型皂苷的途徑，試驗(yàn)成功降低了Ro 在人參發(fā)根中的含量，驗(yàn)證了 -AS 基因在人參皂苷合成中的功能并為研究人參皂苷的合成機(jī)制提供了依據(jù)?；蚓庉嫾夹g(shù)的問(wèn)世給基因功能的探究提供了新的思路和方法，基因編輯技術(shù)不但能從DNA 水平上對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控，還實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)敲入、敲除乃至單堿基替換等，從根本上改變基因的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)蛋白質(zhì)種類、結(jié)構(gòu)的改變和性狀的差異分析基因功能，以反向遺傳學(xué)的思路對(duì)基因組進(jìn)行研究，再輔以基因測(cè)序和互補(bǔ)試驗(yàn)等手段對(duì)該基因的功能進(jìn)行多方面驗(yàn)證。王浩等[33]構(gòu)建了CRISPR/Cas9 基因編輯敲除載體靶向矮牽牛的miR l59a 和miRl59b 基因，miRl59b 缺失的突變體材料與野生型矮牽牛相比，葉片數(shù)在現(xiàn)蕾期增多，葉面積增大，開花延遲，植株變高，研究補(bǔ)充了miR159 基因家族對(duì)于植物觀賞性狀的作用。如果建立起人參基因編輯的體系，就能對(duì)人參的基因組進(jìn)行更全面深入的補(bǔ)充，而人參基因組的深入研究能為基因編輯目的基因提供多方位的選擇。

2.2 調(diào)控皂苷合成

對(duì)藥用植物來(lái)說(shuō)，提高其有效成分的含量具有深遠(yuǎn)意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究開始從基因?qū)用鎸?duì)生物合成和代謝通路進(jìn)行調(diào)控。贠小蕓等[34]基于釀酒酵母三萜類化合物合成路徑，利用CRISPR-Cas9 技術(shù)增加-香樹脂醇上游主路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量并減少支路中關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)調(diào)控前體物質(zhì)的流向，獲得了-amyrin 產(chǎn)量較高的酵母工程菌。人參化學(xué)成分多樣，人參皂苷是人參主要的活性成分之一，是由苷元和糖相連而成的糖苷類化合物，具有抑癌抗癌、免疫調(diào)節(jié)[35]和抗氧化等功效。但皂苷在人參中的含量較低且不宜分離。通過(guò)種植量的擴(kuò)大或提取工藝的優(yōu)化只能在一定程度上緩解這一現(xiàn)狀，并不能從根源上解決問(wèn)題。目前，越來(lái)越多的研究人員對(duì)皂苷的合成和代謝途徑進(jìn)行了深入研究，挖掘皂苷合成途徑中的關(guān)鍵基因，并利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段從基因?qū)用孢M(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響人參皂苷的合成，達(dá)到提高人參皂苷產(chǎn)量的目的。若以人參皂苷合成途徑中的主調(diào)控基因作為靶向基因，增加主路基因的表達(dá)量或抑制、阻斷支路基因的表達(dá)，有望從基因?qū)用鎸?shí)現(xiàn)對(duì)皂苷合成的調(diào)控。如敲除人參環(huán)阿屯醇合酶（CAS）基因，使人參皂苷的前體物質(zhì)氧化角鯊烯更多地流向合成皂苷的路徑。以基因編輯的方式對(duì)人參代謝過(guò)程中的基因進(jìn)行調(diào)控，有望實(shí)現(xiàn)人參特異化和產(chǎn)量化。

2.3 推進(jìn)人參分子育種

傳統(tǒng)的育種工作經(jīng)常圍繞系統(tǒng)育種、雜交育種和誘變育種展開。這些育種方式往往存在過(guò)程繁瑣和工作量大且育種結(jié)果不確定等問(wèn)題，基于分子生物學(xué)的新型育種方式令這一現(xiàn)狀有所改觀。轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)曾備受關(guān)注，但該技術(shù)常因插入位點(diǎn)的不確定導(dǎo)致育種失敗甚至產(chǎn)生對(duì)人不利的結(jié)果?；蚓庉嫾夹g(shù)不但可以實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)改造和定向育種，在較短育種周期內(nèi)培育出產(chǎn)量高品質(zhì)優(yōu)良的品種，而且該技術(shù)只是對(duì)基因起到編輯的作用，與自然變異無(wú)本質(zhì)差別，后期可以篩選出只有目標(biāo)基因突變的材料且Cas9 和載體等不會(huì)遺傳到子代，大大減少了外源基因的污染，基因編輯已經(jīng)迅速引領(lǐng)了新一代育種工作的潮流。Khanday等[36]采用CRISPR/Cas9 敲除了BBM 基因，終止了卵細(xì)胞的減數(shù)分裂行為并使水稻胚胎終止發(fā)育，為物種的無(wú)性繁殖開辟了道路。矮稈品種的選育是主要的育種目標(biāo)之一，水稻SD1 等位基因功能的缺失會(huì)獲得半矮稈的表型。胡雪嬌等[37]敲除了水稻SD1 基因并獲得了純合突變體，其株高較野生型下降了25% 左右，為水稻的育種工作提供了極大便利。人參的栽培歷史短，品種資源匱乏，育種周期長(zhǎng)。人參一般五年生留種，且結(jié)實(shí)數(shù)量少，即便獲得性狀優(yōu)良的遺傳變異類型，也會(huì)因各種條件限制難以推廣。目前人參的分子育種工作還沒(méi)有得到深入展開，如果將基因編輯技術(shù)應(yīng)用到人參輔助育種工作中，有望縮短其育種年限，培育出性狀優(yōu)良、高產(chǎn)高抗的新型人參品種。

2.4 提高人參抗性

人參生長(zhǎng)年限長(zhǎng)，道地性強(qiáng)，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格。目前人參的抗逆抗病機(jī)制并不完善且缺乏相應(yīng)的品系，大大制約了人參產(chǎn)量和品質(zhì)的發(fā)展。如病蟲害等仍是影響人參生長(zhǎng)發(fā)育、減少其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的不利因素，施加大量的化學(xué)制劑雖能短時(shí)間改善這種現(xiàn)狀，但隨著病原生物耐藥性的增加會(huì)適得其反，其藥物殘留不僅打破了種植地生態(tài)系統(tǒng)的平衡，也危害了人類健康。結(jié)合分子生物學(xué)手段選育抗性品種能從根本上增加植物抵抗不利環(huán)境的能力，也一定程度上緩解了病蟲害的困擾?；蚓庉嫾夹g(shù)問(wèn)世以來(lái)在植物育種工作上得到了廣泛應(yīng)用并取得了一定成效，也克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的位點(diǎn)不確定和轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題。雷建峰等[38]構(gòu)建了CRISPR/Cas9 載體敲除野生擬南芥的抗旱負(fù)調(diào)控基因GGB，突變體較野生型失水率降低，抗旱性增加但材料的正常生長(zhǎng)發(fā)育未受影響，為植物的抗逆研究提供了思路，同時(shí)為不同植物GGB 同源基因的研究奠定了基礎(chǔ)。徐鵬等[39]針對(duì)稻瘟病的抗感差異基因Pita、隱形狀態(tài)下的抗稻瘟病菌基因Pi21 和稻瘟病抗性負(fù)調(diào)控基因ERF922，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)編輯并獲得了不同突變類型的材料，對(duì)純合突變的幼苗進(jìn)行稻瘟接種鑒定，發(fā)現(xiàn)其防衛(wèi)基因的表達(dá)量增加，對(duì)稻瘟病的抗性增加。初旸等[40]參照人參全基因組利用生信分析預(yù)測(cè)了人參7個(gè)家族的1 652 個(gè)抗病基因并分析其進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為人參抗性分子育種提供了借鑒。物種之間雖然存在差異，但也存在大量的同源基因，基因組較為完善的模式植物和常見植物種能為人參抗性基因的研究提供參考。利用基因編輯技術(shù)的定向性將抗性基因整合到人參的基因組中，或者敲除對(duì)人參抗性的負(fù)調(diào)控基因，能從根本上提高人參的抗性，開辟人參品質(zhì)改良的新途徑。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

基因編輯技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)創(chuàng)造了一個(gè)又一個(gè)令人矚目的研究成果，得到了無(wú)數(shù)科研工作者的青睞。盡管目前以CRISPR/Cas9 技術(shù)為主的基因編輯系統(tǒng)仍存在一些技術(shù)上的難題，但隨著研究的深入和經(jīng)驗(yàn)的積累這些難題終將被攻克。如果實(shí)現(xiàn)該技術(shù)在人參相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)人參的遺傳育種、品質(zhì)改良以及基因功能研究將具有深遠(yuǎn)意義。雖然人參基因組序列保守性很高，突變和重組率都很低，但與常見的農(nóng)作物和模式植物相比，人參的基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)十分薄弱且范圍較窄，既沒(méi)有完善的基因組數(shù)據(jù)，又缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。盡管對(duì)人參進(jìn)行基因編輯并建立完善體系的難度較大，但基因編輯技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，技術(shù)手段也在不斷更新和進(jìn)步，這為人參基因編輯體系的建立提供了充足的理論知識(shí)和可借鑒的經(jīng)驗(yàn)，因而實(shí)現(xiàn)基因編輯技術(shù)在人參這種藥用植物上的應(yīng)用，并逐步建立成熟的基因編輯體系指日可待，人們也可以從基因?qū)用嬷匦露ㄎ缓蛯徱暼藚⑦@種藥用植物。