徐通潔，劉勇

血管鈣化是一種常見的病理表現(xiàn)，多見于動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎臟疾病等，是導(dǎo)致心血管疾病高患病率和高病死率的直接因素之一。近年來發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）可通過與微小RNA（miRNA）相互作用或其他途徑參與調(diào)節(jié)調(diào)控血管鈣化的過程。本文將介紹LncRNA的功能和特點(diǎn)，并在已有研究基礎(chǔ)上對(duì)不同LncRNAs參與調(diào)節(jié)血管鈣化的機(jī)制做一綜述。

血管鈣化是心腦血管疾病發(fā)生的共同基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為動(dòng)脈硬度增加以及動(dòng)脈順應(yīng)性降低，是引起心腦血管疾病患者死亡的重要因素，且受多種因素調(diào)節(jié)。既往研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化是一個(gè)主動(dòng)、可調(diào)節(jié)的生物學(xué)過程，其過程與骨形成類似，并涉及一些骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）和骨形成蛋白-2（BMP-2）等[1]。臨床將血管鈣化分成四類：動(dòng)脈粥樣硬化鈣化、動(dòng)脈中膜鈣化、心臟瓣膜鈣化和血管鈣過敏[2]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（即LncRNA）種類眾多, 但目前功能明確的LncRNA數(shù)量極少。LncRNA可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等3個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)[3]，并廣泛參與機(jī)體幾乎所有生理和病理過程。已有研究結(jié)果表明LncRNA與心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展有著密切聯(lián)系。

1 LncRNA的結(jié)構(gòu)與功能

長(zhǎng)鏈非編碼RNA屬于非編碼RNA中長(zhǎng)度超過200核苷酸單位的功能性RNA分子，位于細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)，缺乏編碼蛋白的能力[4]。Okazaki等[5]首次在小鼠全長(zhǎng)互補(bǔ)DNA（cDNA）的大規(guī)模測(cè)序過程中發(fā)現(xiàn)了這類新的轉(zhuǎn)錄物，即LncRNA。Ponting等[6]研究表明，LncRNA的來源主要為五種：①編碼蛋白的基因結(jié)構(gòu)中斷形成一段LncRNA；②兩個(gè)未轉(zhuǎn)錄的基因與原來分離很遠(yuǎn)的基因串聯(lián), 產(chǎn)生含多個(gè)外顯子的LncRNA；③非編碼基因在復(fù)制過程中的反轉(zhuǎn)錄作用復(fù)制從而產(chǎn)生LncRNA；④局部的復(fù)制子串聯(lián)產(chǎn)生LncRNA；⑤位因子插入產(chǎn)生一個(gè)有功能的LncRNA。雖然LncRNA來源不一，但研究顯示它們?cè)诨虮磉_(dá)的調(diào)控方面有相似作用[7]，如：參與染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要調(diào)控過程[8]。LncRNA的作用方式包括[9]：①在編碼蛋白基因的上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)；②抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，影響下游基因表達(dá)；③通過與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，進(jìn)而干擾mRNA剪切，產(chǎn)生不同的剪切形式；④與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈,在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA，調(diào)控基因的表達(dá)水平；⑤結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；⑥作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；⑦結(jié)合在特定蛋白上從而改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位；⑧可作為小分子 RNA（如miRNA、piRNA、mascRNA）的前體分子[10]。新近研究發(fā)現(xiàn)：競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）是穩(wěn)定的LncRNA，其大量積累并以不同方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括作為micRNA的誘餌或海綿，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA與靶mRNA相互作用的能力[11-13]。Lv等[14]證明LncRNA H19/miR-675/PTEN是平滑肌細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)軸。另有研究表明LncRNA H19通過海綿吸附miR-148b，從而促進(jìn)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，并抑制細(xì)胞凋亡[15]。

2 促進(jìn)血管鈣化相關(guān)的LncRNAs

2.1 LncRNA TUG1RUNX2是細(xì)胞鈣化的重要轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下，血管平滑肌細(xì)胞并不表達(dá)RUNX2[16]。Cong等[17]研究發(fā)現(xiàn)：LncRNA TUG1可通過海綿作用吸附miR-204-5p并上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）的表達(dá)，從而促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜鈣化。在β-甘油磷酸誘導(dǎo)的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化模型過程中，LncRNA TUG1和RUNX2含量明顯升高，而miR-204-5p含量明顯降低。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-TUG1降低LncRNA TUG1的表達(dá)，能明顯促進(jìn)miR-204-5p的表達(dá)并抑制Runx2、骨鈣素、骨橋蛋白等鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染pcDNA-TUG1過表達(dá)LncRNA TUG1能抑制miR-204-5p的表達(dá)，并使Runx2等相關(guān)蛋白的含量增加。在高膽固醇誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠24周建立主動(dòng)脈瓣膜鈣化模型中，向主動(dòng)脈瓣膜鈣化的ApoE-/-小鼠注入LncRNA TUG1 GapmeR 10使其表達(dá)降低，結(jié)果顯示，miR-204-5p的表達(dá)明顯升高但Runx2的表達(dá)顯著降低。由此可見，LncRNA TUG1在主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，這可能與miR-204-5p結(jié)合從而介導(dǎo)RUNX2的表達(dá)密切相關(guān)。

2.2 LncRNA MALAT1Zhu等[18]研究發(fā)現(xiàn)：BMP-9介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞成骨細(xì)胞分化和鈣化與其誘導(dǎo)的Smad2、Smad3和Smad1/5/8磷酸化密切相關(guān)，而以上磷酸化的Smad蛋白直接與Smad4結(jié)合從而激活靶基因。通過轉(zhuǎn)染Smad4-siRNA沉默Smad4表達(dá)可導(dǎo)致ALP活性下降以及鈣沉積顯著降低，提示Smad4介導(dǎo)的信號(hào)通路可能與血管鈣化密切相關(guān)。Xiao等[19]研究發(fā)現(xiàn)：在鈣化瓣膜和人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VIC）成骨誘導(dǎo)的模型中LncRNA MALAT1表達(dá)顯著升高。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)表明LncRNA MALAT1能抑制miR-204的表達(dá)而促進(jìn)Smad4的活性，促進(jìn)了主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，該研究還通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)Smad4為miR-204的靶蛋白。由此表明：LncRNA MALAT1作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA可通過調(diào)節(jié)miR-204而促進(jìn)Smad4的表達(dá)，從而充當(dāng)人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨分化的正調(diào)節(jié)因子。

2.3 LncRNA H19血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化普遍存在的病理過程，是其重要標(biāo)志，也是動(dòng)脈粥樣硬化的必然結(jié)果[20]。LncRNA H19可通過不同的信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。中國(guó)人群中LncRNA H19的表達(dá)水平與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重程度密切相關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn)[22]：動(dòng)脈粥樣硬化患者血清LncRNA H19的表達(dá)量明顯高于正常健康者，同時(shí)與斑塊旁組織相比，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的LncRNA H19的表達(dá)量也明顯升高。該研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)LncRNA H19可導(dǎo)致p38和p65上調(diào)，而p38和p65分別是MAPK和NF-kB信號(hào)通路的關(guān)鍵因子。上述研究提示，LncRNA H19可能激活MAPK和NF-kB信號(hào)通路從而促進(jìn)血管動(dòng)脈粥樣硬化。

2.4 LncRNA-ES3研究報(bào)道：MiR-34c作為miR-34家族的成員之一,與細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、平滑肌細(xì)胞鈣化、內(nèi)皮細(xì)胞衰老等過程密切相關(guān)[23-25]。Xiao等[26]研究發(fā)現(xiàn)：在高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化及衰老模型中miR-34c-5p的表達(dá)顯著降低，將miR-34c-5p模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染入人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞分別過表達(dá)及抑制miR-34c-5p的表達(dá)。結(jié)果顯示：當(dāng)過表達(dá)miR-34c-5p時(shí)，ALP活性、骨鈣蛋白（OC）和Runx2蛋白水平顯著降低，而抑制miR-34c-5p時(shí)則得到相反的結(jié)果。提示miR-34c-5p可抑制細(xì)胞鈣化。生物信息學(xué)分析表明miR-34c-5p和LncRNA ES3之間有些位點(diǎn)存在互補(bǔ)，而3'UTR區(qū)域提示Bcl-2修飾因子（BMF）與miR-34c-5p有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-ES3通過直接相互作用抑制miR-34c-5p表達(dá)，而miR-34c-5p作用的靶蛋白Bcl-2 修飾因子可促進(jìn)細(xì)胞鈣化及衰老。以上研究表明：人主動(dòng)脈血管平滑肌的鈣化及衰老可受LncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF軸調(diào)節(jié)，LncRNAES3通過直接相互作用抑制miR-34c-5p的表達(dá)。通過抑制LncRNA-ES3表達(dá)可進(jìn)一步抑制人主動(dòng)脈血管平滑肌的鈣化及衰老。

3 抑制血管鈣化的LncRNAs

3.1 LncRNA HOTAIRLncRNA HOTAIR是一種長(zhǎng)2.2kb的非編碼RNA，最初被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)HOX基因表達(dá)[27]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可幫助Polycomb抑制復(fù)合物2（PRC2）（包含EZH2和SUZ12、三甲基化H3賴氨酸K27）對(duì)其靶向基因吸附進(jìn)而調(diào)節(jié)目標(biāo)基因，沉默表觀遺傳[27-29]。Katrina Carrion等[30]研究發(fā)現(xiàn)：人主動(dòng)脈間質(zhì)細(xì)胞在含膠原蛋白-1包被的Bioflex上生長(zhǎng)板（BF-3001C Flexcell International）循環(huán)拉伸14%24 h后，LncRNA HOTAIR的表達(dá)水平降低，而堿性磷酸酶和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)明顯升高。通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制LncRNA HOTAIR表達(dá)后堿性磷酸酶和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bmp-2）的表達(dá)明顯升高。被循環(huán)拉伸14% 24 h后的人主動(dòng)脈間質(zhì)細(xì)胞其WNT/b-CATENIN信號(hào)通路被激活。既往研究表明，WNT/b-CATENIN信號(hào)通路促進(jìn)主動(dòng)脈瓣鈣化[31-34]和其他鈣化過程[35-39]。用WNT激動(dòng)劑處理可導(dǎo)致ALPL和BMP2表達(dá)增加，而抑制了LncRNA HOTAIR的表達(dá)。以上研究表明：在人主動(dòng)脈瓣膜細(xì)胞中長(zhǎng)LncRNA HOTAIR被循環(huán)拉伸及WNT/b-CATENIN調(diào)節(jié)，從而抑制細(xì)胞鈣化。

3.2 LncRNA-ANCR抗分化非編碼RNA是一種包含855個(gè)堿基的LncRNA。研究發(fā)現(xiàn)[40]：LncRNA ANCR在人成骨細(xì)胞分化時(shí)的表達(dá)顯著下降，LncRNA ANCR可通過募集增強(qiáng)子zeste homolog 2而抑制Runx2的表達(dá)，抑制人成骨細(xì)胞的分化。同時(shí)用β-GP處理小鼠血管平滑肌細(xì)胞后，Runx2和BMP-2的表達(dá)量明顯升高，而LncRNA ANCR表達(dá)量顯著降低[41]。構(gòu)建LncRNA ANCR過表達(dá)慢病毒載體并感染小鼠VSMCs，顯示LncRNA ANCR過表達(dá)顯著抑制了β-GP誘導(dǎo)Runx2和BMP-2的升高，同時(shí)鈣化結(jié)節(jié)也明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA ANCR過表達(dá)可抑制NF-KB信號(hào)通路從而減弱動(dòng)脈鈣化。以上研究表明：LncRNA ANCR在β-GP誘導(dǎo)的小鼠VSMCs成骨分化中起到抑制作用，這與減弱NFKB信號(hào)通路密切相關(guān)。提示LncRNA ANCR可能是動(dòng)脈鈣化中的關(guān)鍵性負(fù)性調(diào)節(jié)因子。

3.3 LncRNA GAS5以往研究發(fā)現(xiàn)[42-45]：TGF-β能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化，這與激活TGF-β/Smad3信號(hào)通路密切相關(guān)，SM22α作為血管平滑肌標(biāo)志物在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中扮演了重要角色。LncRNA GAS5能結(jié)合Smad3蛋白，并通過其rSBE元件抑制Smad3的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的血管平滑肌分化，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)Smad3蛋白則可逆轉(zhuǎn)該過程[46]。上述研究表明：LncRNA GAS5在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和成骨分化過程中可能起到重要的抑制作用。

4 LincRNA ENST00000540293

二肽基肽4（DPP4）是766個(gè)氨基酸組成的高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族，它的其中一種催化底物即為腸促胰島素。LincRNA ENST00000540293是一種位于11號(hào)染色體并包含1000個(gè)堿基的基因間LncRNA，目前尚無關(guān)于LincRNA ENST00000540293的文獻(xiàn)報(bào)道。既往研究表明：DPP4不僅在降低血糖中起到重要作用，在其他方面也有獨(dú)特功能[47]。同時(shí)DPP4在多種組織上廣泛表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[48]。我們前期實(shí)驗(yàn)證明DPP4能通過激活ERK/NF-Kβ通路促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞的鈣化，并通過基因芯片篩查與DPP4促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞鈣化相關(guān)的LncRNAs，芯片結(jié)果提示基因間LncRNA ENST00000540293（LincRNA ENST00000540293）在DPP4干預(yù)后表達(dá)顯著降低[49,50]。為進(jìn)一步分析LincRNA ENST00000540293是否與人血管平滑肌鈣化（HVSMCs）相關(guān)，構(gòu)建沉默LincRNA ENST00000540293的轉(zhuǎn)染體并感染人HVSMCs，結(jié)果顯示沉默LincRNA ENST00000540293表達(dá)后，鈣化相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加，如骨形成蛋白-2 （BMP-2）、骨保護(hù)素（OPG）。同時(shí)通過茜素紅染色提示LincRNA ENST00000540293沉默后有明顯鈣化結(jié)節(jié)形成[50]。以上研究表明：LincRNA ENST00000540293是DPP4促進(jìn)人血管平滑肌鈣化潛在負(fù)性調(diào)節(jié)因子，過表達(dá)LincRNA ENST00000540293可能會(huì)抑制人血管平滑肌鈣化。

5 展望

血管鈣化是一個(gè)主動(dòng)的、復(fù)雜可調(diào)的生物學(xué)過程，而動(dòng)脈粥樣硬化等慢性血管鈣化疾病對(duì)中老年人健康和生活造成了很大的影響。越來越多的LncRNA被證實(shí)在調(diào)控血管平滑肌成骨分化過程中扮演著重要角色，如：LncRNA TUG1，LncRNA MALAT1，LncRNA H19，lncRNA-ES3等均可能與血管平滑肌的成骨分化正相關(guān)；而LncRNA HOTAIR，LncRNA-ANCR，LncRNA GAS5，LincRNA ENST00000540293等可能與血管平滑肌的成骨分化負(fù)相關(guān)。然而, 對(duì)于哺乳動(dòng)物的LncRNA及其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍存在不足, 包括LncRNA的數(shù)量及它們的作用機(jī)制。LncRNA作為近年的研究熱點(diǎn)，進(jìn)一步研究LncRNA在血管鈣化過程中的調(diào)控作用，可為血管鈣化診療提供新的方向。