原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力因子的抑制作用

李皓洲，郝旭昇，郭嘉璐，郭 都，鄭曉營，王 碩，楊焯凱，石 超

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是克羅諾桿菌屬中的一種具有鞭毛、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于嬰幼兒奶粉、嬰幼兒米粉、水果、蔬菜等食品中[1]，有極強的致病性。人體感染阪崎克羅諾腸桿菌后，會出現(xiàn)腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等多種疾病，致死率最高可達80%[2]。同時，阪崎克羅諾腸桿菌感染性疾病即使被治愈，近20%的感染病例都會伴有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括腦膿腫、神經(jīng)發(fā)育遲緩、腦積水和四肢癱瘓等[3]。國際食品微生物標準委員會把阪崎腸桿菌描述為“對特定人群造成嚴重危害，危及生命或引起長期慢性實質(zhì)性后遺癥的病原菌”[4]。

阪崎克羅諾腸桿菌的致病性與其運動能力、形成生物被膜、黏附及侵入腸上皮細胞等毒力因子密切相關(guān)[5]。阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的運動能力，這有助于菌體感知外界環(huán)境刺激的變化而確定感染宿主細胞的位點，從而增強菌體對宿主的侵染，并且阪崎腸桿菌的運動能力有助于菌體自身生物被膜的形成[6]；阪崎克羅諾腸桿菌能在不銹鋼、塑料、玻璃、乳膠、硅膠等材料表面形成生物被膜[7-8]，從而提高細菌對洗滌劑、生物抑殺劑、抗生素和宿主防御系統(tǒng)的耐受能力，增強菌體的致病風險[9-10]；并且，阪崎克羅諾腸桿菌能夠黏附及侵入人體腸上皮細胞，這是菌體引發(fā)腦膜炎、菌血癥、敗血癥等感染性疾病的必要途徑[11]。

抗生素是治療細菌感染性疾病的傳統(tǒng)方法，其主要是通過干擾微生物生長過程中的關(guān)鍵步驟，如細胞壁合成、DNA復(fù)制和蛋白合成等[12]，從而抑制微生物生長；雖然這種方式非常有效，但也給細菌帶來選擇性壓力，從而使耐藥菌株被篩選出并成為優(yōu)勢群體。而毒力因子不是細菌存活必需的因素，對細菌并不會構(gòu)成進化上的壓力，因而不易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。與抗生素相比，某些植物源活性物質(zhì)在不干擾細菌正常生長的情況下通過抑制細菌毒力因子進而降低致病菌的致病能力成為一種新型而有效的抗感染方式[12-13]。原兒茶醛（C7H6O3，CAS：139-85-5）是一種從烏蕨中提取的，具有抗動脈粥樣硬化[14]、保護神經(jīng)細胞[15]、防止肝纖維素化[16]、抗病毒[17]等多種生物活性的植物源活性物質(zhì)。已有研究表明，原兒茶醛能夠?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，影響其正常生長，使細菌形態(tài)干癟皺縮，出現(xiàn)畸形，破壞菌體細胞膜完整性，降低細菌胞內(nèi)ATP濃度[18]。但目前原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力因子的影響鮮有研究，作用機制也尚不明確。

本研究旨在探究原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力因子的抑制作用及其可能的作用機制。首先測定原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）和最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentrations，MBC），并確定亞抑制濃度（sub-inhibitory concentration，SIC）；其次，使用SIC的原兒茶醛處理阪崎克羅諾腸桿菌，檢測原兒茶醛對菌體泳動運動性、生物被膜形成能力和黏附及侵入Caco-2細胞能力的影響；最后，通過反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)檢測原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力基因轉(zhuǎn)錄過程的影響。研究旨在為原兒茶醛能夠成為降低阪崎腸桿菌致病風險的抗感染物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌標準菌株ATCC29544和ATCC29004購買于美國模式培養(yǎng)物寄存庫；阪崎克羅諾腸桿菌菌株6-16(1)、18-24(2)、11-18(2)和12-13(2)由Li Zhen等[19]從市面銷售的嬰幼兒配方奶粉及米粉中分離得到。Caco-2細胞（人克隆結(jié)腸腺癌上皮細胞）購于武漢大學細胞保藏中心。

原兒茶醛（高效液相色譜級，純度99.88%） 成都曼思特生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、二水合磷酸氫二鈉、結(jié)晶紫、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 天津科密歐化學試劑有限公司；RNA提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細胞培養(yǎng)液DMEM 美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素 上海碧云天生物技術(shù)公司；慶大霉素 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國HyClone公司。

表1 RT-qPCR所用的引物信息Table 1 Information on primers used for reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction

選取ESA_04030作為內(nèi)參基因[20]及與阪崎克羅諾腸桿菌運動性、生物被膜及黏附與侵入腸上皮細胞有關(guān)的9 種毒力基因[20-21]進行RT-qPCR，基因引物及功能見表1。

1.2 儀器與設(shè)備

5840R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Model 680酶標儀、iQ5 qPCR儀 美國Bio-Rad公司；GHX-9050B-2細菌培養(yǎng)箱 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；HF90細胞培養(yǎng)箱 上海力申科學儀器有限公司；JS680B凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；Nano-200超微量核酸分析儀 杭州奧盛儀器有限公司；KB-900脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；微生物全自動生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司。

1.3 方法

1.3.1 阪崎克羅諾腸桿菌菌懸液制備

將凍存于-80 ℃冰箱中的阪崎克羅諾腸桿菌于胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）平板上活化（37 ℃、12 h），隨后挑取單菌落于胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）培養(yǎng)液中并置于恒溫搖床中培養(yǎng)8 h（130 r/min），使菌體處于對數(shù)生長期。使用pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）清洗并懸浮菌體，最后使用TSB調(diào)整菌懸液，使菌體濃度約為108CFU/mL，備用。

1.3.2 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌MIC和MBC的測定

MIC的測定參照Wiegand等[22]采用的液體稀釋法，并略有修改。具體如下：利用等倍稀釋法配制原兒茶醛質(zhì)量濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的TSB溶液，并將其按照質(zhì)量濃度梯度從高到低的順序加入至96 孔板中（每孔100 μL）。將1.3.1節(jié)中菌懸液稀釋400 倍至菌體濃度為5×105CFU/mL，隨后加入100 μL至各小孔中混勻（最終菌體濃度為2.5×105CFU/mL），實驗設(shè)置TSB含質(zhì)量分數(shù)1%，DMSO作為空白對照組用以校正溶劑光密度。隨即將96 孔板放入酶標儀中測定630 nm波長處光密度，于37 ℃培養(yǎng)24 h后取出再次測定。經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，光密度變化小于0.05所對應(yīng)的原兒茶醛的最小質(zhì)量濃度即為MIC。將高于或等于MIC且能夠使菌體濃度降低3 個對數(shù)值的原兒茶醛的最小質(zhì)量濃度定為MBC[23]。

1.3.3 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌SIC的測定

實驗選用阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544進行后續(xù)研究。參照Li Guanghui等[24]的方法，將1.3.1節(jié)中制備的菌懸液加入至百孔蜂窩板中（每孔125 μL）。隨后，每孔加入125 μL使用TSB（含質(zhì)量分數(shù)1% DMSO）溶解的原兒茶醛溶液，使原兒茶醛質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2、1/4、1/5、1/10、1/20、1/40、1/50、1/100 MIC和1/200 MIC。實驗設(shè)置不含原兒茶醛的菌懸液（含質(zhì)量分數(shù)1% DMSO）作為陰性對照組，設(shè)置TSB肉湯（含質(zhì)量分數(shù)1% DMSO）作為空白對照組，每組設(shè)置4 個平行。同時，于百孔蜂窩板周圍加入無菌水以保證樣品濕度。最后，將樣品置于全自動生長曲線分析儀，于37 ℃條件下每隔1 h測定24 h內(nèi)各孔光密度值并繪制生長曲線，最終選擇低于MIC且對細菌生長無明顯抑制作用的原兒茶醛質(zhì)量濃度為SIC。

1.3.4 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌泳動運動能力的影響

泳動實驗參照Di Bonaventura等[25]采用的軟瓊脂平板法。首先，按照營養(yǎng)配方制備泳動營養(yǎng)平板，具體如下：質(zhì)量分數(shù)0.3%瓊脂、25 g/L的LB肉湯加水溶解后于121 ℃下高壓蒸汽滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃左右時加入原兒茶醛使其質(zhì)量濃度分別為1/50、1/100 MIC和1/200 MIC，同時設(shè)置不含原兒茶醛組進行對照。泳動營養(yǎng)平板冷卻30 min后，取5 μL 1.3.1節(jié)中制備的菌液于平板中央，37 ℃培養(yǎng)10 h后取出平板。使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，并計算泳動圈直徑。

1.3.5 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成能力的影響

原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成能力影響的測定參照Du Wenfang等[26]的方法，具體方法如下：按照前述1.3.1節(jié)中方法制備菌懸液并調(diào)整OD600nm＝1（菌懸液濃度約為109CFU/mL）。隨后，配制質(zhì)量濃度分別為0、1/50、1/100、1/200 MIC的原兒茶醛-菌液混合液，設(shè)置不含菌液和原兒茶醛的TSB為空白對照組（每孔250 μL），并于12 ℃和25 ℃下分別培養(yǎng)24、48、72 h。在24、48、72 h后測定各孔在630 nm波長處的光密度，吸出菌液后使用無菌水漂洗一次，烘干后依次使用1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液染色、無菌水漂洗及體積分數(shù)33%冰乙酸溶解生物被膜-結(jié)晶紫復(fù)合體。最后，測定每孔在570 nm波長處光密度，使用生物被膜形成指數(shù)（specific biofilm formation，SBF）表征不同質(zhì)量濃度原兒茶醛作用下的生物被膜形成能力，SBF按下式計算。

1.3.6 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌黏附及侵入Caco-2細胞影響的測定

本實驗參照Shi Chao等[27]方法，并略有修改。首先，將濃度為1×105cells/mL并處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中恒溫培養(yǎng)18 h，使用無菌PBS輕柔清洗3 次。取1.3.1節(jié)中菌懸液，并添加原兒茶醛溶液，使原兒茶醛的質(zhì)量濃度分別為0、1/50、1/100、1/200 MIC，將樣品置于37 ℃恒溫搖床（100 r/min）培養(yǎng)6 h。取出樣品進行離心（5 000×g、5 min、4 ℃），使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋菌體濃度至106CFU/mL。向預(yù)先培養(yǎng)的細胞中每孔分別加入1 mL菌懸液后離心（600×g、5 min），隨后將樣品放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1 h。

在黏附實驗中，于1 h后取出樣品并吸取孔板內(nèi)液體，使用無菌PBS清洗細胞3 次。向每孔中加入質(zhì)量分數(shù)0.1% Triton X-100，置于4 ℃下處理20 min后使細胞裂解，使用無菌PBS以10 倍梯度稀釋后進行涂布，于37 ℃培養(yǎng)24 h后計算黏附Caco-2細胞的菌體數(shù)量，以各質(zhì)量濃度原兒茶醛作用菌體黏附細胞的細菌總數(shù)/對照組細菌總數(shù)進行數(shù)據(jù)分析。

在侵入實驗中，于1 h后取出樣品并吸取孔內(nèi)液體，使用無菌PBS清洗細胞一次。向每孔中加入1 mL含有100 μL/mL慶大霉素的1% FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)30 min。隨后吸取孔中液體使用無菌PBS清洗3 次，向每孔中加入0.1% Triton X-100并置于4 ℃下作用20 min以裂解細胞。最后，使用無菌PBS以10 倍梯度稀釋進行涂布，37 ℃下培養(yǎng)24 h后計算侵入Caco-2細胞的菌體數(shù)量，以各質(zhì)量濃度原兒茶醛作用菌體侵入細胞的細菌總數(shù)/對照組細菌總數(shù)進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.7 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力基因轉(zhuǎn)錄的影響

本實驗參照韓淇安等[28]方法，并略有修改。按照前述1.3.1節(jié)中方法制備菌懸液。相同體積菌懸液中分別加入不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛溶液使原兒茶醛終質(zhì)量濃度為1/50 MIC和1/100 MIC，將樣品于37 ℃下?lián)u床（130 r/min）培養(yǎng)8 h后進行細菌RNA的提取。分別取1 mL原兒茶醛作用后的菌懸液于1.5 mL無酶離心管中離心（12 000 r/min、2 min），重復(fù)兩次，棄上清液，依據(jù)細菌RNA提取試劑盒Bacteria Kit RNAprep Pure說明書操作進行細菌RNA的提取。使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將菌體RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。按照熒光定量試劑盒配制PCR體系，反應(yīng)總體積為25 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMII 12.5 μL、cDNA 2.0 μL、滅菌水8.5 μL，上、下游引物（10 μmol）各1.0 μL。擴增條件為95 ℃ 30 s，1 個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，71 個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)處理[29]，評估相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗均進行3 次重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)處理使用SPSS軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（n＝3），采用Duncan's ANOVA對結(jié)果間的顯著性進行比較。平均值間差異若達到P≤0.05則認為顯著，P≤0.01則認為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌MIC及MBC的測定結(jié)果

實驗選取兩株標準菌株及4 株嬰幼兒配方米粉和奶粉中的分離菌用于測定原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌MIC和MBC。實驗結(jié)果表明（表2），原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌有著良好的抑菌和殺菌效果，對6 株實驗菌株的MIC和MBC均為2 mg/mL。

阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544常用于菌體毒力因子的研究，且具有本研究所探究的毒力因子表型和基因?qū)W特征[27]，因此選擇ATCC29544作為后續(xù)研究對象。

表2 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of PA against C. sakazakii

2.2 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌SIC的測定結(jié)果

本研究通過測定原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的影響確定SIC，結(jié)果如圖1所示，原兒茶醛質(zhì)量濃度為MIC時，菌體生長完全受到抑制；原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/2 MIC和1/4 MIC時，細菌延滯期明顯增長，并呈現(xiàn)濃度依賴性；原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/50 、1/100、1/200 MIC時，菌體生長狀況與對照組幾乎無明顯差異，該質(zhì)量濃度下細菌可正常生長和繁殖。因此，選擇1/50、1/100 MIC和1/200 MIC為研究所用的SIC。

圖1 不同質(zhì)量濃度原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544生長曲線的影響Fig. 1 Effect of PA on the growth curve of C. sakazakii ATCC29544

2.3 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544泳動能力的影響

由圖2可知，阪崎克羅諾腸桿菌具有較強的泳動能力，但在泳動瓊脂平板中添加1/100 MIC和1/50 MIC的原兒茶醛后，阪崎克羅諾腸桿菌的泳動能力極顯著降低（P＜0.01），泳動圈直徑分別為對照組的88.2%和83.8%。對照組的泳動圈面積為36.32 cm2，經(jīng)質(zhì)量濃度為1/100 MIC和1/50 MIC原兒茶醛處理的阪崎克羅諾腸桿菌的泳動圈面積分別為28.27 cm2和25.52 cm2；而1/200 MIC原兒茶醛能顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌的泳動圈直徑至對照組的92.6%（P＜0.05），其泳動圈的面積為31.17 cm2。因此，綜合分析SIC的原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544的泳動能力有明顯的抑制作用。

圖2 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544泳動能力的抑制作用Fig. 2 PA inhibited swimming motility of C. sakazakii ATCC29544

2.4 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544生物被膜形成能力的影響

原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544在12 ℃和25 ℃下不同時間段（24、48 h和72 h）形成生物被膜能力的影響如圖3所示。結(jié)果表明，在25 ℃下培養(yǎng)24 h后阪崎克羅諾腸桿菌的生物被膜形成能力最強。與對照組相比，不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544的生物被膜形成能力均有顯著的抑制作用（P＜0.05），并且抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性：例如在72 h時，未經(jīng)原兒茶醛作用的阪崎腸桿菌生物被膜SBF為0.87±0.05，經(jīng)1/200、1/100 MIC和1/50 MIC的原兒茶醛處理的阪崎腸桿菌生物被膜SBF分別降低至0.54±0.05、0.52±0.09和0.46±0.03。

2）阿卡狄亞式，即通過追溯藝術(shù)的黃金年代——古代與盛期文藝復(fù)興時期，往現(xiàn)代城市中添加歷史化的能喚起人烏托邦式想象的尺度。

12 ℃下阪崎腸桿菌生物被膜形成能力的最佳時間仍為24 h。原兒茶醛對阪崎腸桿菌的生物被膜形成能力有著顯著的抑制作用（P＜0.05），并隨著質(zhì)量濃度的升高抑制效果增強。在72 h時，未經(jīng)原兒茶醛作用的阪崎腸桿菌生物被膜SBF為1.18±0.06。而經(jīng)1/200、1/100 MIC和1/50 MIC的原兒茶醛處理后SBF分別降低至0.92±0.12、0.78±0.12和0.67±0.06。

圖3 原兒茶醛在12 ℃（A）和25 ℃（B）對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544生物被膜形成能力的影響Fig. 3 Inhibitory effect of PA on biofilm formation of C. sakazakii ATCC29544 at 12 (A) and 25 (B) ℃

2.5 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544黏附及侵入Caco-2細胞的影響

圖4 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544黏附（A）及侵入（B）Caco-2細胞的影響Fig. 4 Effect of PA on adhesion (A) and invasion (B) to Caco-2 cells of C. sakazakii ATCC29544

由圖4A可知，原兒茶醛能夠顯著降低細菌黏附率（P＜0.05），并且呈現(xiàn)濃度依賴性。當原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/200 MIC時，黏附阪崎腸桿菌總量相比對照組降低了1.9%；當原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/100 MIC及1/50 MIC時，細菌黏附率分別下降了76.7%和88.9%，并與對照組呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

由圖4B可知，原兒茶醛對細菌侵入Caco-2細胞的能力具有明顯的抑制作用，并隨著質(zhì)量濃度的增加抑制效果加強。與對照組相比，當原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/200 MIC和1/100 MIC時，阪崎克羅諾腸桿菌侵入率分別降低至60.6%和50.0%，并與對照組呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；當原兒茶醛濃度為1/50 MIC時，細菌侵入率降低至27.3%，與對照組呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

2.6 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544毒力基因轉(zhuǎn)錄的影響

表3 原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌相關(guān)毒力基因表達的影響Table 3 Effect of PA on the expression of virulence genes in C. sakazakii

由表3可知，當原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/50 MIC和1/100 MIC時能夠下調(diào)與阪崎腸桿菌泳動運動性（flhD、fliD、flgJ、motA、motB）、生物被膜（bcsA）、黏附及侵入宿主細胞能力（ompA、ompX）和內(nèi)毒素（lpxB）相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄量。原兒茶醛質(zhì)量濃度在1/50 MIC時對相關(guān)毒力基因轉(zhuǎn)錄量的抑制作用比質(zhì)量濃度在1/100 MIC時更加明顯。編碼阪崎克羅諾腸桿菌內(nèi)毒素基因（lpxB）和生物被膜基因（bcsA），及部分鞭毛合成基因（flgJ、fliD）相比于實驗中其他致病基因，轉(zhuǎn)錄過程受原兒茶醛影響更加明顯。

3 討 論

本研究首先通過測定MIC和MBC初步評價了原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺效果，并選擇1/50、1/100 MIC和1/200 MIC為實驗所用SIC。隨后選取了原兒茶醛處理后亞抑制態(tài)的菌體進行毒力因子抑制機理的研究。結(jié)果表明，原兒茶醛對本研究中使用的阪崎腸桿菌的MIC和MBC均為2 mg/mL，可見該天然產(chǎn)物抑菌作用良好。已有學者探究了其他植物源活性物質(zhì)對阪崎腸桿菌的抑菌效果：馬蘭提取物丁香酸及烏蕨葉提取物質(zhì)原兒茶酸對阪崎腸桿菌ATCC29544的MIC為5 mg/mL[2,30]，阿魏莖根提取物阿魏酸對阪崎腸桿菌ATCC29544的MIC為2.5 mg/mL[31]。因此，在諸多植物源化合物中原兒茶醛對阪崎腸桿菌的抑制效果良好。

細菌的運動能力有助于菌體生物被膜的形成及菌體與宿主的相互作用，從而增強菌體的致病能力[32]。本實驗結(jié)果表明，原兒茶醛能夠顯著或極顯著減小阪崎腸桿菌的泳動圈直徑，能夠有效抑制其運動性，同時，實驗發(fā)現(xiàn)與阪崎腸桿菌鞭毛合成或運動功能相關(guān)的基因（motA、motB、fliD、flgJ、flhD等）轉(zhuǎn)錄量顯著下調(diào)。類似地，Inamuco等[33]證明香芹酚能夠使沙門氏菌蛋白合成受阻從而降低致病菌的運動能力；Amalaradjou等[20]也證明肉桂醛能夠影響多種與運動相關(guān)基因的表達而使其運動區(qū)域面積顯著降低。本實驗中下調(diào)基因motA和motB是鞭毛基本結(jié)構(gòu)——基體組成蛋白的必需基因，另外flhD操縱子的表達水平在細菌的運動速度控制中起著“樞紐”的作用[34-35]。因此，猜測原兒茶醛通過影響編碼鞭毛蛋白的基因表達或鞭毛功能從而降低阪崎腸桿菌的運動能力。

在生物被膜形成能力實驗中，選取了對食品生產(chǎn)及生活具有指導意義的實驗溫度：12 ℃是歐洲議會和理事會于2004年制定的食品衛(wèi)生規(guī)則條例中食品工業(yè)操作環(huán)境溫度，25 ℃即普通環(huán)境下的室溫。生物被膜在形成過程中會經(jīng)歷游離態(tài)、可逆黏附、不可逆黏附、被膜成熟及主動分散5 個階段[36]。本研究結(jié)果表明，在實驗溫度下生物被膜形成能力24 h時達到最大，隨后SBF顯著降低，推測該結(jié)果可能是由于生物被膜培養(yǎng)一段時間后進入主動分散階段。結(jié)果表明：在實驗溫度（12 ℃及25 ℃）下，原兒茶醛能夠極顯著降低阪崎腸桿菌生物被膜形成能力。類似地，Xu Yunfeng等[37]發(fā)現(xiàn)SIC 1/64、1/32 MIC下的安石榴苷能夠使金黃色葡萄球菌生物被膜形成指數(shù)由3.7分別下降至1.9和0.4；Du Wenfang等[26]研究認為1/10 MIC濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯可顯著降低單增李斯特菌ATCC19114在15、30、37 ℃下的生物被膜形成量。在本研究中，原兒茶醛能夠使與生物被膜形成的相關(guān)毒力基因下調(diào)，包括鞭毛合成基因（如motA、motB、fliD、flgJ、flhD等）以及生物被膜結(jié)構(gòu)組成基因（如bcsA）。bcsA作為纖維素合酶催化亞基的編碼基因，在纖維素合成及促進腸桿菌科胞外多糖生成中至關(guān)重要[38]。Amalaradjou等[20]實驗結(jié)果顯示750 μmol/L的反式肉桂醛使阪崎腸桿菌與鞭毛相關(guān)的基因fliD、flgJ、flhD轉(zhuǎn)錄量極顯著下降。因此，推斷原兒茶醛能夠通過影響生物被膜形成相關(guān)基因的表達來實現(xiàn)對其毒力的調(diào)控。

黏附及侵入腸上皮細胞是阪崎克羅諾腸桿菌致病的關(guān)鍵步驟，由阪崎腸桿菌所引起的腦膜炎、菌血癥等癥狀均與該毒力密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，原兒茶醛能夠降低阪崎腸桿菌黏附及侵入Caco-2細胞的能力。多種天然物質(zhì)具有抑制致病菌黏附或/和侵入宿主細胞的功能：Li Guanghui等[24]的研究結(jié)果表明安石榴苷可有效降低沙門氏菌黏附Caco-2細胞的能力；Fan Qiuxia等[39]研究顯示1/32 MIC和1/16 MIC下的輔酶Q0使李斯特菌CMCC54004黏附及侵入Caco-2細胞能力下降，并且相關(guān)毒力基因actA、inlA、inlB、plcA、plcB轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)下降趨勢。OmpA和OmpX是阪崎腸桿菌黏附及侵入宿主過程中的重要功能膜蛋白，OmpA作為細胞外膜極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，通過維持細胞菌體形態(tài)和親水化合物的跨膜傳遞，從而影響菌體黏附宿主的過程[40]，OmpX的生物學功能尚不清楚，但有研究者認為它能與腸桿菌科細胞表面的外來蛋白結(jié)合，從而引起細胞的防御機制，這種結(jié)合親和力用于實現(xiàn)細胞黏附和侵襲[41]。研究顯示，原兒茶醛可下調(diào)ompA和ompX等相關(guān)毒力基因轉(zhuǎn)錄水平，因此，猜測原兒茶醛能夠通過影響ompA和ompX的轉(zhuǎn)錄量從而干擾阪崎腸桿菌對腸上皮細胞的黏附和侵入。

4 結(jié) 論

本研究以原兒茶醛為對象，以阪崎克羅諾腸桿菌為作用主體，探究了原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌多種毒力因子的抑制作用。首先測定原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC和MBC，并確定了SIC；隨后探究了原兒茶醛對菌體泳動運動能力、生物被膜形成、黏附及侵入Caco-2細胞的影響；最后利用RT-qPCR技術(shù)檢測了原兒茶醛對菌體毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄量的影響。結(jié)果表明原兒茶醛對本研究中6 株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC和MBC均為2 mg/mL，SIC的原兒茶醛能夠顯著抑制菌體泳動運動能力，減弱菌體在12 ℃和25 ℃下生物被膜的形成能力，并能夠降低菌體黏附及侵入Caco-2細胞的能力，同時能夠下調(diào)9 個相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄量。本研究結(jié)果表明，原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌的毒力因子有著良好的抑制作用，有潛力作為抗生素補充劑或抗毒性物質(zhì)，從而達到預(yù)防及控制阪崎克羅諾腸桿菌感染性疾病的目的。