姜黃素對(duì)幽門螺桿菌及其誘導(dǎo)人胃GES-1細(xì)胞損傷的影響

任嬌艷，茍 娜，高 立，楊宜婷，李 良，袁爾東,

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東 廣州 510000；3.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是革蘭氏陰性、微需氧、可在人胃黏膜中定植的螺旋桿菌。雖然世界上50%的人口攜帶Hp，但大多數(shù)感染人群是無癥狀的。其中，10%～15%的Hp感染個(gè)體會(huì)發(fā)展成慢性炎癥，導(dǎo)致萎縮性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌[1]。世界衛(wèi)生組織將Hp定為第Ⅰ類致癌物，認(rèn)為其具有顯著引發(fā)胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。所以，根除Hp是治療其相關(guān)疾病最有效的方法。

正常情況下人體胃內(nèi)的pH值大約在1～2之間，因此極少有細(xì)菌能夠在胃中存活下來，Hp能夠在此環(huán)境下生存主要是依靠其能夠產(chǎn)生具有強(qiáng)大活力的脲酶[3]，該種酶可以充分分解胃液中少量的尿素而產(chǎn)生氨，在Hp周圍形成一片“氨云”，中和胃酸，保護(hù)細(xì)菌不被胃酸殺滅。脲酶占據(jù)整個(gè)Hp可溶蛋白的10%～15%，這不僅是其區(qū)別于其他胃腸道微生物的主要特征，也是其重要的定植和致病因子[4]。

臨床上，根除Hp感染主要是通過“三聯(lián)療法”，包括兩種抗生素（克拉霉素和阿莫西林或甲硝唑）和質(zhì)子泵抑制劑（奧美拉唑、艾普拉唑）[5]。但是，這種療法對(duì)胃腸道有明顯的副作用，如嘔吐、腹瀉、腹痛、惡心等。而且，因?yàn)榭股刂委熌褪苄圆畈⒖赡軐?dǎo)致治療中斷，因此這種方案逐漸被棄用。

很多研究將天然活性成分用于防治Hp感染，如抗氧化劑、益生菌、維生素以及各種植物提取物等，這些物質(zhì)開啟了控制Hp相關(guān)炎癥和癌前病變的新維度[6-7]。姜黃素是一種多酚類黃色素，從植物姜黃（Curcuma longa）的根莖中提取得到，可作為香料、色素、染料等用于護(hù)膚產(chǎn)品和紡織工業(yè)[8]。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗氧化和抗感染功效[9-10]，并可以抑制多種寄生蟲、細(xì)菌和病原真菌等，對(duì)Hp、枯草芽孢桿菌、惡性瘧原蟲等具有良好的抑制作用[11]，且具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。姜黃素對(duì)腫瘤具有良好的預(yù)防和強(qiáng)效抑制作用[12-13]，可通過致胃癌細(xì)胞突變[14]、調(diào)控細(xì)胞周期[15]、致細(xì)胞凋亡[16]以及抑制腫瘤細(xì)胞血管生成等途徑來抑制人胃癌細(xì)胞的增殖，因此，姜黃素也被認(rèn)為是預(yù)防胃癌的一種安全性較高的活性物質(zhì)，已成為食品、功能性食品以及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)基于Hp感染引起的胃黏膜細(xì)胞損傷，對(duì)姜黃素的作用及機(jī)制進(jìn)行研究。在研究姜黃素對(duì)Hp體外抑制活性的基礎(chǔ)上，對(duì)抑制脲酶活力的方式進(jìn)行探討；構(gòu)建Hp感染人胃GES-1細(xì)胞損傷模型，研究姜黃素對(duì)Hp感染引起胃黏膜損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hp、人胃GES-1細(xì)胞 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科。

姜黃素（純度90%，食品級(jí)） 鄭州百思特食品添加劑有限公司；無菌脫纖維綿羊血 廣州鴻泉生物科技有限公司；胎牛血清 美國Gibco公司；腦心浸液（brain heart infusion，BHI）、CM0331B哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基 廣州翔博生物科技有限公司；革蘭氏染色液試劑盒 青島海博生物技術(shù)有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；萬分之一電子天平、高壓滅菌鍋、厭氧培養(yǎng)罐（細(xì)菌） 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；UV754N紫外-可見分光光度計(jì)INESA上海儀電分析儀器有限公司；XDS-1B倒置相差顯微鏡 北京榮興光恒科技有限公司；離心機(jī) 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 Hp的活化及菌懸液的制備

取出-80 ℃凍存Hp菌株，37 ℃水浴2 min解凍，吸取100 μL Hp菌液，涂布接種至含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%無菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃、微需氧（含5% O2、10% CO2、85% N2）、飽和濕度環(huán)境倒置培養(yǎng)48 h用于實(shí)驗(yàn)或傳代。將Hp刮取收集于含10%胎牛血清的BHI培養(yǎng)液中，制備成活菌懸液。

1.3.2 Hp菌落濃度的檢測

在600 nm波長處檢測Hp活菌懸液的OD值，以O(shè)D600nm＝1時(shí)細(xì)菌濃度109CFU/mL為標(biāo)準(zhǔn)[17]，確定Hp活菌懸液細(xì)菌濃度。

1.3.3 Hp生長曲線的繪制

Hp菌株平板培養(yǎng)48 h后，用滅菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落至10 mL含10%胎牛血清的BHI中進(jìn)行液體培養(yǎng)。每隔12 h從中吸取100 μL Hp培養(yǎng)液至900 μL新鮮BHI中稀釋。再吸取不同濃度梯度液體50 μL轉(zhuǎn)至固體培養(yǎng)基，微需氧條件下培養(yǎng)48 h，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 姜黃素對(duì)Hp的抑制作用

以0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解姜黃素，在含10%胎牛血清的BHI培養(yǎng)液中進(jìn)行梯度稀釋，過0.22 μm濾膜，備用。在24 孔板中加入10 μL菌懸液（109CFU/mL）和990 μL含25、50、100、200、400、800 μmol/L姜黃素的BHI培養(yǎng)液[18]。同時(shí)，陰性對(duì)照組加入不含姜黃素的BHI培養(yǎng)液和菌懸液，陽性對(duì)照組加入含100 μg/mL阿莫西林和50 μg/mL克拉霉素混合抗生素[19]的BHI培養(yǎng)液和菌懸液。37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h后，適當(dāng)稀釋后并轉(zhuǎn)至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定最低抑菌濃度。

1.3.5 姜黃素對(duì)脲酶的體外抑制活性

脲酶能水解尿素產(chǎn)生氨，通過貝特洛比色法測定所產(chǎn)生氨態(tài)氮的含量即可了解脲酶的活力。其作用原理是，氨在堿性條件下與苯酚、次氯酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生一種靛酚藍(lán)-藍(lán)色絡(luò)合物，該絡(luò)合物的色度與NH4+濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，且靈敏度高、重現(xiàn)性好[20]。

分別將脲酶溶液（10 U/mL）與不同濃度（0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L）的姜黃素溶液各100 μL混勻，于37 ℃避光反應(yīng)20 min。加入50 mmol/L尿素100 μL，在室溫下避光反應(yīng)20 min。加入貝特洛顯色液200 μL，混勻，在室溫下避光反應(yīng)10 min，測定595 nm波長處OD值（OD樣品）。對(duì)照組則加入含乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖液，同樣方法檢測OD值（OD對(duì)照）。以相應(yīng)溶液的溶劑作為空白組測OD值（OD空白）。同時(shí)，以槲皮素作為陽性對(duì)照。計(jì)算剩余酶活力（residual activity，RA）（式（1））及半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）[21]。

1.3.6 姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞的影響

將人胃GES-1細(xì)胞以2.5×106個(gè)/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。細(xì)胞融合至80%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)，按每孔1×104個(gè)將人胃GES-1細(xì)胞接種至96 孔板培養(yǎng)，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁12 h后加入姜黃素，使其終濃度為68、136、680 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），培養(yǎng)4 h后棄去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩溶解結(jié)晶，測定570 nm波長處OD值（OD樣品）。對(duì)照組不加姜黃素溶液，同樣方法檢測OD值（OD對(duì)照）。以相應(yīng)溶液的溶劑作為空白組測OD值（OD空白），按式（2）計(jì)算人胃GES-1細(xì)胞存活率。

1.3.7 姜黃素對(duì)Hp感染人胃GES-1細(xì)胞的影響

按每孔1×104個(gè)將人胃GES-1細(xì)胞接種至96 孔板培養(yǎng)，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁12 h后，按照感染復(fù)度100將Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液加入96 孔板與人胃GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。然后加入姜黃素，使其終濃度為0、68、136、680 μmol/L；對(duì)照組為未加Hp菌懸液和姜黃素的人胃GES-1細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用1.3.6節(jié)MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均獨(dú)立平行測定3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并作圖，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hp生長曲線

圖1 Hp生長曲線Fig. 1 Growth curve of Hp

如圖1所示，在0～48 h期間Hp細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期，48～84 h期間細(xì)菌處于穩(wěn)定生長期，84 h后細(xì)菌處于衰退期。因此，為保證菌株生長活力，在后續(xù)抑菌實(shí)驗(yàn)中的液體培養(yǎng)階段，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，使Hp菌株處于對(duì)數(shù)生長期。

2.2 姜黃素對(duì)Hp生長的抑制作用

圖2 阿莫西林-克拉霉素及姜黃素對(duì)Hp生長的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect of amoxicillin-clarithromycin and curcumin on Hp

參照臨床中用于治療Hp感染的三聯(lián)療法（艾普拉唑10 mg、阿莫西林1 000 mg、克拉霉素500 mg），采用阿莫西林與克拉霉素質(zhì)量比為2∶1的混合抗生素作為抑菌實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照藥物。如圖2所示，混合抗生素對(duì)Hp生長有很好的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)，阿莫西林和克拉霉素的最低抑制濃度分別為100 μg/mL和50 μg/mL。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇100 μg/mL阿莫西林和50 μg/mL克拉霉素聯(lián)用作為陽性對(duì)照藥物。

如圖2所示，姜黃素可明顯抑制Hp的生長。隨著姜黃素濃度的升高，其抑菌效果也更加明顯，其對(duì)Hp的最低抑制濃度為200 μmol/L。有研究認(rèn)為，姜黃素可直接抑制Hp生長，可能是由于其具有良好的膜滲透性，破壞了Hp細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致Hp死亡[22]。

2.3 姜黃素對(duì)脲酶活力的抑制作用

極高的脲酶活力是Hp重要的生物學(xué)特征之一[23]。脲酶在胃部高酸環(huán)境下定植，會(huì)引起胃炎和胃潰瘍等疾病，長期感染甚至?xí)?dǎo)致胃癌[24-25]。脲酶廣泛存在于自然界，酵母、真菌、藻類、細(xì)菌和一些高等植物都能產(chǎn)生脲酶，且各種來源的脲酶的氨基酸序列均相似[26]。因此，本實(shí)驗(yàn)以脲酶（刀豆）作為Hp脲酶的研究模型，來探討活性物質(zhì)對(duì)Hp的抑制機(jī)理。目前，己有許多黃酮類化合物被證明為脲酶的抑制劑，其中槲皮素是公認(rèn)效力最強(qiáng)的脲酶抑制劑[27]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇以槲皮素作為陽性對(duì)照物，研究姜黃素對(duì)脲酶（刀豆）活力的抑制作用，以探討姜黃素抑制Hp的作用機(jī)制。

圖3 姜黃素和槲皮素對(duì)脲酶（刀豆）的抑制效果Fig. 3 Inhibitory effect of curcumin and quercetin on Jack bean urease activity

如圖3所示，姜黃素和槲皮素對(duì)脲酶（刀豆）都有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其IC50分別為1.735 mmol/L和0.801 mmol/L。由此推斷，姜黃素可能通過抑制Hp脲酶的活力，減弱其在胃部的定植能力，并降低脲酶這一毒力因子對(duì)胃部的損傷，從而可能對(duì)Hp誘導(dǎo)的胃部損傷起到一定的緩解作用。

2.4 姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞增殖的影響

圖4 姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞增殖的影響Fig. 4 Effect of curcumin on GES-1 cells proliferation

姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞增殖有明顯影響（圖4）。以68 μmol/L姜黃素作用12 h后，人胃GES-1細(xì)胞存活率略有增長，但與正常細(xì)胞相比不顯著。當(dāng)姜黃素濃度和作用時(shí)間繼續(xù)增加，人胃GES-1細(xì)胞存活率明顯下降。以680 μmol/L姜黃素作用48 h后，其對(duì)人胃GES-1細(xì)胞的抑制率已達(dá)到52.661%。說明高濃度姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用。

有研究顯示，姜黃素可通過下調(diào)胃癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)來抑制體內(nèi)腫瘤生長[28]。本研究中，較高濃度姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞增殖的抑制作用，可能是由于姜黃素通過降低Bcl2表達(dá)或增強(qiáng)活性氧產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期[29]。

2.5 姜黃素對(duì)Hp感染人胃GES-1細(xì)胞的影響

圖5 姜黃素對(duì)Hp感染人胃GES-1細(xì)胞增殖的影響Fig. 5 Effect of curcumin on the viability of GES-1 cells injured by Hp

圖6 人胃GES-1細(xì)胞形態(tài)的變化（20×）Fig. 6 Morphological change of GES-1 cells (20 ×)

圖5 所示為姜黃素對(duì)Hp感染人胃GES-1細(xì)胞存活率的影響。如圖6A所示，生長狀態(tài)良好的人胃GES-1細(xì)胞形態(tài)為梭形或扁平多邊形，呈小島狀成片貼壁生長。當(dāng)被Hp感染24 h后，如圖6B所示，人胃GES-1細(xì)胞變圓，貼壁細(xì)胞減少，漂浮細(xì)胞增多，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞周圍出現(xiàn)碎片，同時(shí)細(xì)胞存活率與相對(duì)存活率為100%的未感染Hp的細(xì)胞相比顯著下降（圖5）。說明Hp可明顯抑制人胃GES-1細(xì)胞的增殖，且作用時(shí)間越長其抑制效果越明顯。

如圖6C所示，在Hp感染24 h后加入68 μmol/L姜黃素，12 h后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)人胃GES-1細(xì)胞貼壁細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)有一定程度的復(fù)原；同時(shí)，人胃GES-1細(xì)胞存活率略有升高，但不顯著。其原因可能在于姜黃素對(duì)Hp生長和脲酶活力具有抑制作用，在一定程度上減緩了Hp對(duì)人胃GES-1細(xì)胞的損害，對(duì)于維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量具有一定效果[30]。

當(dāng)姜黃素濃度提高到136、680 μmol/L時(shí)，人胃GES-1細(xì)胞存活率明顯下降。Yang Hongru等的研究也得到類似的結(jié)果，雖然姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞具有良好的抑制作用，但是較高濃度的姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞也會(huì)呈現(xiàn)一定抑制作用[31]。其原因可能是高濃度姜黃素對(duì)Hp和脲酶的抑制作用仍不足以緩解其對(duì)人胃GES-1細(xì)胞增殖的抑制作用。因此，過高濃度的姜黃素對(duì)Hp感染引起的人胃GES-1細(xì)胞損傷并無明顯作用。

因此，對(duì)于Hp感染引起的胃黏膜細(xì)胞損傷，可考慮使用具有增殖胃黏膜細(xì)胞作用的活性成分（如紫葳科植物、蔓越橘、佛手柑提取物等[32-33]）與具有抑制Hp生長作用的姜黃素協(xié)同作用，從而達(dá)到抑制Hp生長、修復(fù)胃黏膜損傷的目的。

3 結(jié) 論

姜黃素具有良好的抑制Hp增殖作用（最低抑菌濃度為200 μmol/L），并可明顯抑制脲酶活力（IC50＝1.735 mmol/L）。同時(shí)，姜黃素對(duì)人胃GES-1細(xì)胞具有一定的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。對(duì)于Hp感染引起的人胃GES-1細(xì)胞損傷，高濃度姜黃素可導(dǎo)致細(xì)胞存活率的下降。因此，姜黃素對(duì)Hp和脲酶的抑制作用仍不足以緩解Hp對(duì)人胃GES-1細(xì)胞的損傷?？梢钥紤]將具有促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖作用的活性物質(zhì)與姜黃素協(xié)同使用，以修復(fù)Hp對(duì)胃黏膜細(xì)胞造成的損傷。