石油水溶性成分對褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)生殖、發(fā)育及種群動(dòng)態(tài)的影響

王嘉儀，沙婧婧，張暉，周斌，劉春辰，王悠,*

1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島 266003 2. 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，青島 266237 3. 國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心，青島 266033 4. 國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評(píng)估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266033

隨著世界石油需求不斷增長，石油的勘探、開采和運(yùn)輸活動(dòng)日益頻繁，海上油田溢油、油輪溢油事故頻發(fā)，海洋原油污染對海洋環(huán)境與海洋生態(tài)系統(tǒng)所造成的破壞成為全球關(guān)注的重點(diǎn)。比如，2010年發(fā)生的墨西哥灣漏油事件被稱作“前所未有的生態(tài)災(zāi)難”，海鳥、魚類等動(dòng)物大規(guī)模死亡，原油分散液會(huì)影響浮游植物和動(dòng)物的生物群落，對魚類的胚胎和心臟發(fā)育造成影響，對哺乳動(dòng)物造成生存威脅，溢油還造成該地沿海沼澤地?fù)p失率大幅增加，珊瑚礁表現(xiàn)出受損的狀態(tài)[1-4]；2011年渤海灣“蓬萊19-3油田溢油事故”導(dǎo)致約870 km2海水水質(zhì)降至劣Ⅳ類海水，海洋生物棲息環(huán)境遭到破壞，污染海域的浮游生物種類和多樣性降低，海洋生物幼體如魚卵和仔稚魚受到損害，底棲生物體內(nèi)石油烴含量明顯升高[5]，對渤海海域生態(tài)系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定危害極大。石油的水溶性成分(water-accommodated fraction, WAF)所含的有效毒性成分比分散液和成品油高[6]，是引起海洋生物毒性效應(yīng)的主要組分。

海洋浮游動(dòng)物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)中起到承上啟下的關(guān)鍵作用，其種群動(dòng)態(tài)與群落結(jié)構(gòu)變化直接或間接地影響著各營養(yǎng)級(jí)的節(jié)律、規(guī)模以及初級(jí)生產(chǎn)力和生物資源的最終歸宿，而生殖、發(fā)育又是決定該變化的關(guān)鍵過程[7]。目前在國內(nèi)外尚未見到系統(tǒng)研究石油水溶性成分對浮游動(dòng)物生殖與發(fā)育影響的報(bào)道。褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)是我國常見的浮游動(dòng)物，可以分布在由溫帶到熱帶的半咸水和海水水體中，是生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中理想的模式生物。因此，本文選用褶皺臂尾輪蟲為受試生物，在實(shí)驗(yàn)生態(tài)條件下研究石油的水溶性成分(WAF)對其生長、生殖及發(fā)育的影響。研究將為評(píng)估海洋溢油污染對近海生態(tài)系統(tǒng)的潛在威脅與影響提供基礎(chǔ)的研究依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 褶皺臂尾輪蟲的培養(yǎng)

所用褶皺臂尾輪蟲由其休眠卵孵化而得，孵化條件依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期建立的孵化體系[8-9]。將褶皺臂尾輪蟲休眠卵投置于裝有滅菌海水的三角瓶內(nèi)，于光照培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃，光照周期12 h∶12 h，光照強(qiáng)度60 μmol·(m2·s)-1，期間投喂密度為1.0×106cells·L-1的小球藻(Chlorellasp.)。整個(gè)孵化時(shí)間大約持續(xù)3～7 d。孵化后，挑選活潑健壯的褶皺臂尾輪蟲非混交卵雌體，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3代后備用，培養(yǎng)條件同孵化條件。

1.2 WAF的制備及濃度測定

原油取自勝利油田，且置于陰涼處避光保存。原油與過濾滅菌后的海水按體積比1∶9混合，室溫下用磁力攪拌機(jī)連續(xù)攪拌24 h，然后將混合液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置4 h，分離下層水相即為原油WAF母液，制備過程注意避光。母液置于冰箱(4 ℃)避光保存，每2 d重新制備。WAF母液中石油濃度依據(jù)海洋監(jiān)測規(guī)范(GB17378.4—2007)用分光光度法來測定，根據(jù)原油標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，通過測定母液在225 nm的OD值換算而成。在本實(shí)驗(yàn)條件下，測得原油WAF母液的濃度為5.0 mg·L-1。

圖1 原油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of crude oil

1.3 WAF對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性效應(yīng)

5.0 mg·L-1為本實(shí)驗(yàn)條件下得到的WAF最大濃度，設(shè)為本實(shí)驗(yàn)的濃度上限。在預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)置5個(gè)WAF濃度，分別為0.5、1.0、2.0、4.0和5.0 mg·L-1，同時(shí)設(shè)置空白對照組；每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行(n=3)。從馴養(yǎng)的輪蟲中挑選出活潑健壯的帶卵雌體，收集0～2 h所產(chǎn)的幼蟲(齡期<2 h)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在24孔加蓋培養(yǎng)板中進(jìn)行，每孔放入10只活潑健壯的輪蟲幼體，并注入500 μL不同濃度的WAF、500 μL小球藻餌料。將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃，每24 h更換孔內(nèi)溶液。在24、48、72和96 h時(shí)用解剖鏡觀察并記錄個(gè)體死亡數(shù)、存活數(shù)。采用概率單位法計(jì)算種群增長的半數(shù)有效抑制濃度(EC50)。

褶皺臂尾輪蟲生長抑制及死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國實(shí)驗(yàn)材料學(xué)會(huì)制定的輪蟲急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)指南[10]，即褶皺臂尾輪蟲沉于24孔板底部、肢體及內(nèi)臟活動(dòng)比較微弱則為受到抑制；纖毛和體內(nèi)運(yùn)動(dòng)停止、內(nèi)部組織皺縮、輪盤縮回、肢體及內(nèi)臟活動(dòng)完全喪失則視為死亡。

1.4 WAF對褶皺臂尾輪蟲生殖與發(fā)育的影響

在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)置3個(gè)WAF濃度，分別為1.0、3.0和5.0 mg·L-1，同時(shí)設(shè)置空白對照組；每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行(n=3)。其余實(shí)驗(yàn)體系的構(gòu)建依據(jù)1.3中所述進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)最初的72 h內(nèi)，每4小時(shí)觀察一次，72 h后每隔8 h觀察一次，每次觀察時(shí)間記為x年齡(h)，記錄該年齡的個(gè)體存活數(shù)、死亡數(shù)、產(chǎn)卵數(shù)以及產(chǎn)幼數(shù)，并將新生幼體和死亡個(gè)體及時(shí)移出。實(shí)驗(yàn)持續(xù)到所有輪蟲個(gè)體全部死亡為止。

依據(jù)收集到的數(shù)據(jù)，應(yīng)用動(dòng)態(tài)生命表方法獲得每個(gè)平行組的特定年齡存活率(lx)和特定年齡繁殖率(mx)，其定義如下：(1)特定年齡存活率(lx)為x年齡組開始時(shí)存活個(gè)體的百分?jǐn)?shù)； (2)特定年齡繁殖率(mx)為x年齡組平均每個(gè)個(gè)體所產(chǎn)的雌性后代數(shù)。

在上述研究的基礎(chǔ)上依據(jù)下列公式計(jì)算種群的各項(xiàng)參數(shù)，從而建立輪蟲生命表[11-13]。

R0=∑(lxmx)

T=∑(xlxmx)/R0

rm=lnR0/T

E0=(∑lx)/l0

λ=erm

式中：R0、rm、T、E0和λ分別為凈生殖率、內(nèi)稟增長率、世代時(shí)間、生命期望和周限增長率，l0為lx(x=0)。

用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的方法研究WAF對褶皺臂尾輪蟲發(fā)育的影響[9,14]。以目標(biāo)生物生殖期周期長短，以及生殖前期(pre-reproductive phase)、生殖期(reproductive phase)和生殖后期(post-reproductive phase)的時(shí)間分配變化作為檢測指標(biāo)開展研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

以Sigmaplot 12.0作圖，SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)方差分析和回歸分析，采用ANOVA方法分析WAF暴露組與空白對照組之間的差異，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 急性毒性效應(yīng)

處理組與對照組中的種群密度隨著脅迫時(shí)間的延長均呈現(xiàn)出逐漸增加的變化趨勢。與對照組相比，低濃度組(0.5和1 mg·L-1)的種群密度在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均高于對照組，但未達(dá)到顯著水平(P≥0.05)；其他處理組的種群密度均低于對照組，表現(xiàn)出比較明顯的生長抑制作用，且濃度越高抑制作用越顯著(P<0.05) (圖2)。EC50的計(jì)算結(jié)果顯示，脅迫24 h內(nèi)未出現(xiàn)半數(shù)有效抑制現(xiàn)象，48、72和96 h的EC50分別為5.42、4.81和4.39 mg·L-1(表1)，說明WAF對種群增長的抑制作用隨著脅迫濃度的增高而不斷增強(qiáng)。

圖2 不同濃度的石油水溶性成分(WAF)對褶皺臂尾輪蟲種群密度增長的影響Fig. 2 Effects of water-accommodated fraction (WAF) on the population density of B. plicatilis

2.2 WAF對褶皺臂尾輪蟲生殖和發(fā)育的影響

WAF對褶皺臂尾輪蟲的特定年齡存活曲線顯示，不同濃度的WAF能顯著影響褶皺臂尾輪蟲的特定年齡存活率。對照組得到輪蟲的特定年齡存活率的一般模式，在140 h后特定年齡存活率開始下降，最長生存時(shí)間約為410 h。與對照組相比，低濃度組(1 mg·L-1)的存活率開始下降的時(shí)間稍早于對照組，但下降趨勢較緩，最長生存時(shí)間與對照組基本相同。隨著WAF濃度升高，輪蟲存活率開始下降的時(shí)間提前，曲線走勢開始陡峭，最長生存時(shí)間逐漸縮短。5 mg·L-1的WAF處理組的存活率在75 h開始下降，最長生存時(shí)間為348 h (圖3)。

表1 WAF對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of acute toxicity of WAF on B. plicatilis

WAF對褶皺臂尾輪蟲的特定年齡繁殖曲線顯示，不同濃度的WAF能影響褶皺臂尾輪蟲的特定年齡繁殖率。對照組的正常輪蟲雌體一生中有3～5個(gè)生殖峰，生殖高峰大多出現(xiàn)在輪蟲孵化出生后的74～135 h，繁殖達(dá)到最高峰時(shí)特定年齡繁殖率達(dá)到1.8，直至蟲齡約15 d時(shí)完全停止繁殖(圖4)。與對照組相比，1和3 mg·L-1處理組的特定年齡繁殖率最大值略有下降。高濃度組(5 mg·L-1)的特定年齡繁殖率顯著降低，生殖高峰不明顯，約在12 d完全停止繁殖，繁殖期縮短。

圖3 不同濃度WAF作用下的褶皺臂尾輪蟲特定年齡存活率(lx)曲線Fig. 3 Age-specific survivorship curves of B. plicatilis in relation to different concentrations of WAF

在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上建立不同濃度WAF脅迫條件下褶皺臂尾輪蟲的生命表(表2)。結(jié)果顯示，隨著WAF濃度的升高，凈生殖率(R0)、內(nèi)稟增長率(rm)、周限增長率(λ)和生命期望(E0)均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，最高值均出現(xiàn)在1 mg·L-1濃度組；隨著WAF濃度繼續(xù)升高，R0、rm、λ和E0均逐漸降低，呈現(xiàn)比較顯著的濃度-效應(yīng)變化趨勢，至5 mg·L-1時(shí)降至最低(P<0.05)。但世代周期(T)逐步延長，至5 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高值(P<0.05)。rm和λ的變化較其他指標(biāo)更靈敏，可以用以指示或評(píng)價(jià)WAF脅迫的指示指標(biāo)。

圖4 不同濃度WAF作用下的褶皺臂尾輪蟲特定年齡繁殖率(mx)曲線Fig. 4 Age-specific fecundity curves of B. plicatilis in relation to different concentrations of WAF

表2 暴露于不同濃度WAF的褶皺臂尾輪蟲的生命表參數(shù)Table 2 Demographic parameters of B. plicatilis exposed to different concentrations of WAF

注：R0、T、rm、E0和λ為凈生殖率、世代周期、內(nèi)稟增長率、生命期望和周限增長率。

Note:R0,T,rm,E0andλrepresent net reproductive rate, generation time, intrinsic growth rate, life expectancy and finite rate of increase, respectively.

WAF會(huì)對褶皺臂尾輪蟲的發(fā)育產(chǎn)生影響。如表3所示，1 mg·L-1的WAF脅迫能延長褶皺臂尾輪蟲的平均壽命與生殖期，縮短胚胎發(fā)育時(shí)間；之后隨著WAF脅迫濃度的升高，褶皺臂尾輪蟲的平均壽命縮短，胚胎發(fā)育與生殖前期延長，生殖期與生殖后期縮短。以最高濃度組5 mg·L-1為例，與對照組相比，胚胎發(fā)育期與生殖前期延長了39.1%和32.6%，生殖期、生殖后期與平均壽命分別減少了32.4%、35.6%和26.8% (P<0.05)。結(jié)果說明，WAF脅迫能延遲褶皺臂尾輪蟲個(gè)體的發(fā)育，導(dǎo)致其進(jìn)入生殖期的時(shí)間滯后、生殖期的時(shí)間縮短。

3 討論(Discussion)

不同濃度WAF的急性毒性脅迫對褶皺臂尾輪蟲的種群增長影響不同。一方面，低濃度(0.5和1 mg·L-1)的WAF在96 h內(nèi)能促進(jìn)褶皺臂尾輪蟲的種群增長，但未達(dá)到顯著水平(P≥0.05)，而較高濃度組的WAF(3和5 mg·L-1)則對種群增長產(chǎn)生較顯著的抑制作用，且隨著濃度的增大，毒性效應(yīng)增強(qiáng)。另一方面，在WAF脅迫24 h內(nèi)未出現(xiàn)種群增長的半數(shù)有效抑制現(xiàn)象，之后的EC50呈現(xiàn)出48 h>72 h>96 h的變化情況，說明WAF的毒性與其在生物體內(nèi)的蓄積時(shí)間密切相關(guān)，蓄積時(shí)間越長毒性越大。石油烴的毒性主要是由低分子烷烴和芳香烴的組成及其含量所決定，其中毒性最大的是微量溶于水的芳香烴類化合物，如萘、蒽、芘和苯并芘。在污染產(chǎn)生的較短時(shí)間內(nèi)，中小分子量的多環(huán)芳烴，如萘、菲、芘和苯并芘是對海洋生物危害最大的4種成分[15]。這些污染物通常會(huì)使生物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，影響生長、代謝和繁殖等多個(gè)生命過程。例如，苯并芘會(huì)抑制三角褐指藻的生長，導(dǎo)致其脂質(zhì)過氧化損傷明顯[16]；還會(huì)導(dǎo)致櫛孔扇貝的精巢和卵巢發(fā)育緩慢，濾泡有空隙，出現(xiàn)大量與配子重吸收有關(guān)的血細(xì)胞，卵母細(xì)胞大量退化，精子數(shù)量降低[17]。海水中的原油可導(dǎo)致雙齒圍沙蠶脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性升高，說明雙齒圍沙蠶體內(nèi)啟動(dòng)了消除氧自由基和解毒的一系列生化響應(yīng)[18]。本課題組的前期研究結(jié)果也表明，污染物脅迫及環(huán)境變化均會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)活性氧含量增加，氧化脅迫程度加劇，并且氧化脅迫加劇與生物損傷之間存在明顯的正相關(guān)性[19-21]，因此，推測WAF對褶皺臂尾輪蟲種群動(dòng)態(tài)及生長的抑制作用可能與WAF產(chǎn)生的氧化脅迫有關(guān)。

另一方面，生殖變化或損傷是影響褶皺臂尾輪蟲種群動(dòng)態(tài)變化的根本原因。本研究結(jié)果表明，WAF脅迫下褶皺臂尾輪蟲的生殖作用受到影響。生殖期的變化說明褶皺臂尾輪蟲個(gè)體生殖過程受到影響：WAF脅迫能延遲輪蟲個(gè)體的發(fā)育，導(dǎo)致其進(jìn)入生殖期的時(shí)間滯后，生殖期的時(shí)間縮短。生殖毒性回應(yīng)在種群水平上可以表現(xiàn)為生殖率的下降。隨著WAF濃度的增加，褶皺臂尾輪蟲的特定年齡繁殖率(mx)不斷下降，高濃度WAF能夠使輪蟲的凈生殖率(R0)、內(nèi)稟增長率(rm)、周限增長率(λ)和生命期望(E0)降低，這說明褶皺臂尾輪蟲的無性生殖過程受到影響。不少研究表明，石油類污染物能夠影響海洋生物的生殖、發(fā)育過程。例如，WAF能夠延遲斑馬魚胚胎發(fā)育和孵化，導(dǎo)致發(fā)育停止或畸形[22]。萘?xí)绊戄喯x的平均壽命，使其胚胎發(fā)育期縮短，凈生殖率下降[23]；并會(huì)導(dǎo)致火腿許水蚤的存活率及產(chǎn)卵率降低，卵囊脫落，進(jìn)而導(dǎo)致種群衰退[24]。而本課題組前期的研究表明，持久性有機(jī)污染物多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)的亞急性脅迫能損傷褶皺臂尾輪蟲的卵黃腺，并導(dǎo)致輪蟲體內(nèi)活性氧含量與Ca2+水平增加，使其體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷[14,19,25]，并推測活性氧(ROS)介導(dǎo)的氧化損傷與凋亡是導(dǎo)致其生殖毒性的根本原因。另一方面，PBDEs脅迫會(huì)誘導(dǎo)褶皺臂尾輪蟲的生殖作用產(chǎn)生策略性響應(yīng)，從無性生殖向有性生殖轉(zhuǎn)變[9]。筆者期望進(jìn)一步探討WAF脅迫下褶皺臂尾輪蟲生殖作用的響應(yīng)機(jī)制，聚焦于輪蟲的氧化損傷與生殖毒性的關(guān)系以及輪蟲生殖策略的變化。

表3 暴露于不同濃度WAF的褶皺臂尾輪蟲各主要發(fā)育時(shí)段的歷時(shí)Table 3 Developmental period duration of B. plicatilis exposed to different concentrations of WAF

本研究在褶皺臂尾輪蟲中觀察到了WAF的低劑量興奮效應(yīng)，隨著WAF濃度的升高，凈生殖率(R0)、內(nèi)稟增長率(rm)、周限增長率(λ)和生命期望(E0)均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，最高值均出現(xiàn)在1 mg·L-1濃度組。Sarma等[26]同樣在輪蟲中發(fā)現(xiàn)了低劑量興奮效應(yīng)現(xiàn)象，在Cu2+脅迫下，輪蟲的種群增長出現(xiàn)低濃度刺激，高濃度抑制的現(xiàn)象。劉星辰和鞠青[27]發(fā)現(xiàn)，低濃度WAF對三角褐指藻和小球藻的生長有輕微的促進(jìn)作用，高濃度的WAF通過影響浮游植物的生理過程和生化組成，降低其細(xì)胞密度。低濃度的WAF對輪蟲有刺激效應(yīng)，其原因可能是輪蟲體內(nèi)的自由基含量升高，從而促進(jìn)其生理生化代謝及繁殖；且低濃度WAF還可促進(jìn)輪蟲餌料藻的生長，進(jìn)而促進(jìn)輪蟲的生長。

在生命表的變量當(dāng)中，與繁殖有關(guān)的參數(shù)通常比存活率對毒物更敏感[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，在相同污染物脅迫條件下輪蟲的存活率和世代時(shí)間(T)與對照組相比變化不大，但其凈生殖率(R0)和內(nèi)稟增長率(rm)卻受到明顯抑制[29]；在毒物慢性毒性的脅迫下，觀察到在一些輪蟲和大型溞(Daphniamagna)種群的凈生殖率降低(R0)[30-32]。這些研究結(jié)果與本文的結(jié)果一致。因此，凈生殖率(R0)和內(nèi)稟增長率(rm)可以用作靈敏指示褶皺臂尾輪蟲響應(yīng)外源脅迫的標(biāo)志指標(biāo)。