余曉宏 劉嶼 曾蓮 楊艷玲 王洲 李衛(wèi)

1.云南省第二人民醫(yī)院口腔內(nèi)科 昆明 650012；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科 昆明 650031

牙周炎等牙周組織疾病造成牙周支持組織的破壞，牙周附著的喪失，最終導(dǎo)致牙齒的松動(dòng)、脫落。牙周炎治療的最終目的不但要控制炎癥和阻止病變的進(jìn)一步發(fā)展，而且還要形成新的牙槽骨和牙骨質(zhì)[1]。牙周膜干細(xì)胞分化是骨組織再生和修復(fù)的關(guān)鍵，因此研究牙周膜干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制對(duì)于臨床上治療牙周組織疾病具有重要作用。

人牙周膜包圍干細(xì)胞亞群，其負(fù)責(zé)維持和再生牙周組織結(jié)構(gòu)和功能。這些細(xì)胞表現(xiàn)出多能性，可以分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和牙齒成牙骨質(zhì)細(xì)胞，以及形成牙骨質(zhì)和牙周膜樣組織，因此通常被稱為牙周膜干細(xì)胞，大量的動(dòng)物研究[2]提供了可靠的證據(jù)支持牙周膜干細(xì)胞可用于牙周組織再生的設(shè)想。因此牙周組織再生治療的一個(gè)關(guān)鍵因素為促干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，目前雖已證實(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板衍生因子、雌激素等具有明確的骨向誘導(dǎo)作用。但對(duì)于牙周組織的修復(fù)治療仍需積極尋求更多的高效藥物。

由豬胎兒的牙齒材料[3]制備的釉基質(zhì)衍生物（enamel matrix derivative）由疏水性蛋白質(zhì)的混合物組成，其中牙釉蛋白含量超過(guò)90%。在牙周骨內(nèi)缺損的治療中，釉基質(zhì)衍生物被證明可以支持骨缺損的再生[4]。有研究[5-6]已經(jīng)特別報(bào)道了釉基質(zhì)衍生物可以在體外刺激成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，并促進(jìn)體內(nèi)牙骨質(zhì)和牙周組織的再生。在體外，釉基質(zhì)衍生物能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞的凋亡[7]。另有研究[8]表明，將釉基質(zhì)衍生物放入猴牙周缺損模型中，觀察到幾乎完全的無(wú)細(xì)胞牙骨質(zhì)修復(fù)，膠原組織緊密地結(jié)合于新生的牙槽骨。雖然研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了釉基質(zhì)衍生物有促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖及牙槽骨修復(fù)的作用，但其中的調(diào)控作用機(jī)制還很不明確，其對(duì)牙周膜干細(xì)胞的作用還有待進(jìn)一步研究。人牙周膜干細(xì)胞成骨分化受到多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，如Wnt通路、Smad蛋白通路、p38有絲分裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路、Notch等[9]。Wnt信號(hào)通路已被證明在間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程均產(chǎn)生調(diào)控作用[10-11]，而Wnt信號(hào)通路是否參與調(diào)控釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨向分化尚無(wú)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)旨在探討Wnt信號(hào)通路在釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中是否起作用，從而進(jìn)一步闡明釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

釉基質(zhì)衍生物（Straumann公司，瑞士），DDK1（Sigma公司，美國(guó)），Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（Gibco公司，美國(guó)）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)）、青鏈霉素（Gibco公司，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）；Ⅰ型膠原，骨鈣素，β-連環(huán)蛋白，RunX2，CaMKⅡ及NLK引物合成（上海生工生物工程有限公司），Trizol提取試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）；Super TaqMan OneStep RT-qPCR Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）； β-連環(huán)蛋白抗體（Abcam公司，英國(guó)）、RunX2抗體（Santa Cruz Biochemistry公司，美國(guó)），CaMKⅡ（Abcam公司，英國(guó)）、NLK抗體（Abcam公司，英國(guó)），對(duì)應(yīng)二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；STRO-1（Abcam公司，英國(guó)）、CD146流式抗體（Abcam公司，英國(guó)）；Masson Trichrome染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、Von Kosa’s染液（北京索萊寶科技有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（FORMA 3131；Thermo公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（TS100；Nikon公司，日本），多功能酶標(biāo)儀（FC；Thermo公司，美國(guó)），超低溫冰箱-80 ℃（L93-12L；Thermo公司，美國(guó)），低溫高速離心機(jī)（GS-15R；Beckman公司，美國(guó)），其余細(xì)胞培養(yǎng)耗材（Corning公司，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（ABI-7500；ABI公司，美國(guó)），低溫離心機(jī)（CF-16RX；日立公司，日本），流式細(xì)胞儀（CyFlow Space，Partec GmbH公司，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人牙周膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)和鑒定 取因正畸而拔除的健康前磨牙，患者年齡11～14歲。用尖刀刮取牙根部的牙周膜組織，將組織剪成1 mm3碎塊。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）和不含胎牛血清的α-基礎(chǔ)Eagle’s 培養(yǎng)基（α-minimum Eagle’s medium，α-MEM）各清洗標(biāo)本2次，將標(biāo)本接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入適量含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM，置于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并生長(zhǎng)匯合達(dá)80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后擴(kuò)大培養(yǎng)。

選取生長(zhǎng)狀況良好的第3代細(xì)胞，收集細(xì)胞后制備成單細(xì)胞懸浮液。向流式管中加入50 μL細(xì)胞懸浮液，使每管細(xì)胞數(shù)目約為106，向管中分別加入50 μL稀釋后的STRO-1、CD146單克隆抗體，并輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；然后用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞2次。每管加入250 μL緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)釉基質(zhì)衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞接種于96孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)目為1×103，培養(yǎng)基體積為200 μL，調(diào)零孔只加入200 μL培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，按實(shí)驗(yàn)分組更換相應(yīng)培養(yǎng)液，使釉基質(zhì)衍生物的終濃度為10、20、50、100 mg·L-1，空白對(duì)照組不處理，分別于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d后取出1塊板。向每個(gè)孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，并計(jì)算細(xì)胞活力：

1.2.3 人牙周膜干細(xì)胞膠原合成及礦化結(jié)節(jié)形成檢測(cè) 取第3代人牙周膜干細(xì)胞，以5×104mL-1接種1 mL至24孔板，培養(yǎng)24 h后，每組3孔重復(fù)，對(duì)照組換成含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM，實(shí)驗(yàn)組在相同的培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的釉基質(zhì)衍生物（20、50或100 mg·L-1），空白對(duì)照組不做處理，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、4周后進(jìn)行以下檢測(cè)。

Trichrome染色檢測(cè)膠原合成情況：按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定后，加入Bouin’s溶液56 ℃ 1 h，放入魏格特鐵蘇木精染液10 min，清洗后，放入比布列西酸性品紅液10～15 min，再放入苯胺藍(lán)溶液10 min，清洗后放入1%乙酸5 min，脫水后顯微鏡觀察。

茜素紅染色法檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況：接種等量人牙周膜干細(xì)胞至24孔爬片，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，分別換液為含20、50、100 mg·L-1釉基質(zhì)衍生物的DMEM，空白對(duì)照組換等體積不含釉基質(zhì)衍生物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2、4周后，用茜素紅染色法將礦化結(jié)節(jié)染成紅色。將固定后的細(xì)胞爬片用PBS洗滌后，浸入5%硝酸銀水溶液中10 min，日光下放置暴曬30 min，蒸餾水洗滌，乙醇系列脫水，二甲苯透明，顯微鏡觀察。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)成骨分化標(biāo)志物mRNA水平收集生長(zhǎng)狀況良好的第3代細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)因子Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ）、骨鈣素（osteocalcin）、RunX2 mRNA水平的表達(dá)情況。引物序列見(jiàn)表1。PCR程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

表1 qRT-PCR的引物序列Tab 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.2.5 Western blot、qRT-PCR檢測(cè)DDK1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響 選取第3代人牙周膜干細(xì)胞，以5×104mL-1接種1 mL至6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM 2 mL，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，分別換液為含20、50、100 mg·L-1釉基質(zhì)衍生物的DMEM和含0.05 mg·mL-1DKK1的DMEM，空白對(duì)照組換等體積DMEM，共5組，每組6孔重復(fù)。培養(yǎng)7 d后，其中3孔提取總RNA，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK在mRNA水平的表達(dá)情況；另外3孔提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)Western blot檢測(cè)β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)體外實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析檢驗(yàn)差異顯著性，用LSD-t檢驗(yàn)比較兩組間差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜干細(xì)胞流式鑒定

采用組織塊消化培養(yǎng)的原代細(xì)胞，5～10 d可見(jiàn)組織塊周圍明顯有原代細(xì)胞爬出（圖1A），進(jìn)一步通過(guò)有限稀釋克隆法得到純化的人牙周膜干細(xì)胞。純化后的人牙周膜干細(xì)胞形態(tài)豐滿，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核聚集在中心，細(xì)胞呈反射狀、旋渦狀生長(zhǎng)，2周左右即可達(dá)80%匯合（圖1B）；流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示第3代人牙周膜干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD146（陽(yáng)性）、STRO-1（陽(yáng)性），證實(shí)所取得細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源（圖2）。

圖1 人牙周膜干細(xì)胞形態(tài)特征Fig 1 Morphological characteristics of human periodontal ligament stem cells

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人牙周膜干細(xì)胞表面抗原的表達(dá)Fig 2 Flow cytometry detection of surface antigens of human periodonatal ligament stem cells

2.2 釉基質(zhì)衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞活力的影響

CCK8檢測(cè)不同濃度（10、20、50、100 mg·L-1）釉基質(zhì)衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示（圖3），與空白對(duì)照組相比，在20 mg·L-1以上釉基質(zhì)衍生物均明顯促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的活力，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，在作用3 d后效果最明顯（P＜0.05）。

2.3 釉基質(zhì)衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

以釉基質(zhì)衍生物（0、20、50、100 mg·L-1）分別培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞2、4周后，以qRT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)因子Ⅰ型膠原、骨鈣素、RunX2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)因子Ⅰ型 膠原、骨鈣素、RunX2表達(dá)（P＜0.05）（圖4）。

圖3 釉基質(zhì)衍生物對(duì)牙周膜干細(xì)胞活力的影響Fig 3 Effects of enamel matrix derivatives on proliferation of periodontal ligament stem cells

圖4 qRT-PCR檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)Fig 4 Expression of osteogensis-related genes of periodontal ligament stem cells detected by qRT-PCR

2.4 釉基質(zhì)衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞膠原合成及礦化能力的影響

以不同濃度的釉基質(zhì)衍生物（0、20、50、100 mg·L-1）作用牙周膜干細(xì)胞2、4周后，檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞生成膠原情況以及礦化結(jié)節(jié)形成情況；Trichrome染色結(jié)果顯示（圖5A～H），隨著釉基質(zhì)衍生物的濃度越高，牙周膜干細(xì)胞合成膠原量顯著增多（P＜0.05），且呈劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明釉基質(zhì)衍生物能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞膠原的合成能力；茜素紅染色結(jié)果顯示（圖5I～P），隨著釉基質(zhì)衍生物的濃度越高，牙周膜干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成量越多（P＜0.05），并且呈劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明釉基質(zhì)衍生物能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的能力。

2.5 Wnt信號(hào)通路在不同濃度釉基質(zhì)衍生物作用下對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響

使用釉基質(zhì)衍生物（20、50、100 mg·L-1）或0.05 mg·L-1DDK1分別培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞7 d后，以qRT-PCR和Western blot檢測(cè)β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK的表達(dá)。結(jié)果顯示，在mRNA水平（圖6A～D），釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞RunX2、CaMKⅡ及NLK的表達(dá)，而降低β-連環(huán)蛋白表達(dá)，并且呈現(xiàn)出一定劑量依賴效應(yīng)（P＜0.05）；在蛋白質(zhì)水平（圖6E）與mRNA表達(dá)一致，而當(dāng)人牙周膜干細(xì)胞經(jīng)DDK1處理后，釉基質(zhì)衍生物的效果被明顯抑制。

圖5 Trichrome和茜素紅染色檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞膠原合成和礦化能力Fig 5 Collagen synthesis and mineralization nodule formation of periodontal ligament stem cells detected by Trichrome staining and alizarin red staining

3 討論

目前針對(duì)牙周組織疾病治療的難點(diǎn)和重點(diǎn)都在于如何有效提升牙槽骨再生的水平。 Seo等[10]于2004年首次從人第三磨牙中分離出牙周膜干細(xì)胞，在一定的培養(yǎng)條件下，牙周膜干細(xì)胞能夠分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和膠原形成細(xì)胞。牙槽骨再生需要細(xì)胞同時(shí)具備較強(qiáng)的礦化能力和膠原合成能力，牙周膜干細(xì)胞移植可以是牙槽骨再生的有效方法[11]。

Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt/CaMKⅡ/NLK信號(hào)通路。目前在干細(xì)胞參與成骨分化的過(guò)程中研究較多的為Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，但是對(duì)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程中的作用尚有爭(zhēng)議[12-13]，有分析稱Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的抑制或促進(jìn)作用可能與細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境、生長(zhǎng)狀態(tài)和所受刺激等因素有關(guān)。

圖6 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞β-連環(huán)蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK的表達(dá)Fig 6 Expression of β-catenin, RunX2, CaMKⅡ and NLK in periodontal ligament stem cells detected by qRT-PCR and Western blot

牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白是牙齒發(fā)育期間產(chǎn)生的以牙釉蛋白衍生蛋白為主的異質(zhì)混合物。熱處理形式的牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白具有調(diào)節(jié)人牙周膜細(xì)胞的間充質(zhì)和非間充質(zhì)分化途徑的能力[14]，但由于從人牙胚不易獲得牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，臨床上常用的釉基質(zhì)衍生物是由豬牙胚中提取得到的釉基質(zhì)蛋白純化獲得。牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白相對(duì)容易獲得，因此對(duì)于釉基質(zhì)衍生物調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化將有助于進(jìn)一步理解其發(fā)揮臨床療效的作用機(jī)制，對(duì)于釉基質(zhì)衍生物的廣泛臨床應(yīng)用顯得意義重大，同時(shí)能夠?yàn)檠乐芙M織缺損的診療提供一定參考。

本實(shí)驗(yàn)分離出牙周膜干細(xì)胞，并提供流式細(xì)胞儀鑒定，證明了牙周膜干細(xì)胞的干細(xì)胞特性。在給予濃度梯度的釉基質(zhì)衍生物刺激后，細(xì)胞增殖能力得到顯著提高，同時(shí)細(xì)胞膠原形成和礦化能力以及成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)也被明顯增強(qiáng)，提示釉基質(zhì)衍生物能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖，還能夠明顯促進(jìn)其成骨分化，其結(jié)論與王爽等[15]的發(fā)現(xiàn)一致；另外，在濃度梯度釉基質(zhì)衍生物作用的同時(shí)施加DKK-1，結(jié)果顯示牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力被明顯抑制，表明抑制Wnt信號(hào)通路可抑制釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的能力，進(jìn)一步表明釉基質(zhì)衍生物促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞分化的作用可能是通過(guò)對(duì)經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活，從而使糖原合成酶激酶（glycogen synthetase kinase，GSK）-3β大量被磷酸化，促進(jìn)β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)下游一系列靶基因的表達(dá)，調(diào)控了牙周膜干細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程。另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)衍生物能促進(jìn)CaMKⅡ、NLK表達(dá)，且其表達(dá)也與牙周膜干細(xì)胞成骨分化程度呈正相關(guān)，DDK-1作用后，CaMKⅡ、NLK表達(dá)被明顯抑制。提示，釉基質(zhì)衍生物對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用也可能涉及非經(jīng)典的Wnt/CaMKⅡ/NLK信號(hào)通路。因此，本研究將有助于進(jìn)一步明確釉基質(zhì)衍生物促牙周膜干細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制，對(duì)釉基質(zhì)衍生物應(yīng)用于臨床治療牙槽骨再生將能夠提供一定理論參考。但由于釉基質(zhì)衍生物包含多種蛋白質(zhì)，具體是哪些蛋白質(zhì)或者哪種蛋白質(zhì)的某一肽段發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步研究。