胰腺癌是消化系統(tǒng)中預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，早期診斷困難，且具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，確診后患者平均生存期<6個月，5年生存率<5%[1]。研究表明，腫瘤微環(huán)境包括多種細(xì)胞和分子，在腫瘤的發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中具有重要作用[2]。其中以腫瘤浸潤性細(xì)胞、炎性細(xì)胞為代表的免疫反應(yīng)是腫瘤微環(huán)境中的主要參與者之一。研究證實，在卵巢癌中，高比例的CD8+T細(xì)胞或CD45RO+記憶T細(xì)胞浸潤腫瘤組織是有利于預(yù)后的指標(biāo)[3]，相反如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等，可通過抑制患者的免疫反應(yīng)來加速腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[4]。巨噬細(xì)胞是主要的免疫群體之一，而免疫細(xì)胞在復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中扮演著十分重要的角色[5]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察了CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞在胰腺癌組織中的表達(dá)，并探討其表達(dá)水平與臨床病理及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 基本資料

收集2016年6月至2018年10月間在四川大學(xué)華西醫(yī)院被確診為胰腺癌的52例患者的腫瘤組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療。52例患者中，男28例，女24例，平均年齡(61.32±10.31)歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；TNM分期為Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后經(jīng)病理診斷證實為胰腺癌者；(2)在四川大學(xué)華西醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療者；(3)預(yù)計生存期≥1個月者(手術(shù)至患者失訪或死亡的時間)；(4)臨床資料及隨訪資料完整者；(5)未參與其他研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位惡性腫瘤患者；(2)繼發(fā)性腫瘤患者；(3)接受過放射治療、化學(xué)治療者；(4)合并精神疾病無法配合研究者；(5)不愿意參與本研究者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會核準(zhǔn)，所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 組織標(biāo)本取材及檢測方法

所有患者的手術(shù)操作及標(biāo)本采集均由同一組經(jīng)驗豐富的醫(yī)師完成。胰腺癌組織標(biāo)本取自典型病變部位，癌旁組織取自距胰腺癌病灶邊緣5 cm處。組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除離體后，常規(guī)取材，采用10%中性福爾馬林溶液固定，進(jìn)行逐級脫水、透明，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為4 μm，然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法染色，以檢測組織標(biāo)本中CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)及分組方法

陽性細(xì)胞染色標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，著色與背景的對比清楚。應(yīng)用100倍顯微鏡選取組織標(biāo)本中3個陽性染色高密度區(qū)域，然后應(yīng)用400倍顯微鏡對上述區(qū)域進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，取平均值。以區(qū)域內(nèi)CD163+巨噬細(xì)胞≤18個為低表達(dá)組，CD163+巨噬細(xì)胞>19個為高表達(dá)組；以區(qū)域內(nèi)CD204+巨噬細(xì)胞≤20個為低表達(dá)組，CD204+巨噬細(xì)胞>21個為高表達(dá)組。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察并分析CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，影響胰腺癌組織中CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)的因素，以及不同CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平患者的總生存率[隨訪終點為患者死亡或至本研究數(shù)據(jù)收集終點(2019年1月末)]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

胰腺癌組織中CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞計數(shù)分別為(18.54±2.64)個、(23.45±3.26)個，均高于癌旁組織的(13.18±1.54)個、(17.16±2.84)個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.646,P<0.05；t=10.491，P<0.05)。

2.2 CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的單因素分析

單因素分析顯示，在胰腺癌組織中，CD163+高表達(dá)患者與低表達(dá)者相比，在腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD204+高表達(dá)患者與低表達(dá)者相比，在腫瘤大小、血管侵犯方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

2.3 影響胰腺癌組織中CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)的Logistic回歸分析

將單因素分析中顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CD163+高表達(dá)的獨立危險因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)CD163+高表達(dá)的概率約為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的28倍(OR=28.596，P=0.001)；TNM分期是CD204+高表達(dá)的危險因素，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者出現(xiàn)CD204+高表達(dá)的概率約為Ⅰ～Ⅱ期患者的1.9倍(OR=1.926，P=0.029)；其余指標(biāo)未見明顯差異(P>0.05)。

2.4 CD163+、CD204+表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

在52例胰腺癌患者中，CD163+高表達(dá)者和低表達(dá)者均為26例，低表達(dá)患者的平均生存時間為(12.05±3.56)個月，高于高表達(dá)患者[(8.88±2.52)個月]，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.519，P<0.01)；CD204+高表達(dá)患者為25例，低表達(dá)患者為27例，低表達(dá)患者的平均生存時間為(9.43±3.11)個月，高于高表達(dá)患者[(6.01±2.26)個月]，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.278，P<0.01)。見圖1。

圖1 胰腺癌患者的Kaplan-meier生存曲線 A 不同CD163+表達(dá)水平的患者 B 不同CD204+表達(dá)水平的患者

3 討論

胰腺癌具有高度侵襲性，缺乏早期診斷癥狀，發(fā)病率與病死率相近，總體預(yù)后極差[6]。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，與腫瘤細(xì)胞自身的(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))內(nèi)在環(huán)境有關(guān)，且與腫瘤的生長關(guān)系密切[7]。腫瘤組織中浸潤的炎性細(xì)胞大部分為巨噬細(xì)胞[8]。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫反應(yīng)的重要組分，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是外周血單核細(xì)胞浸潤至實體腫瘤組織中而演變成的巨噬細(xì)胞，依據(jù)其活化狀態(tài)和功能可分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1型)和替代性活化的巨噬細(xì)胞(M2型)。活化的M1型TAM介導(dǎo)機(jī)體獲得性免疫和腫瘤細(xì)胞的凋亡；而M2型TAM與M1型相反，其可發(fā)揮誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、腫瘤新生血管和淋巴管生成、免疫抑制等作用，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9]。腫瘤細(xì)胞可分泌相關(guān)因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，致使腫瘤組織中TAM以M2型為主[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，TAM在結(jié)直腸癌、肺癌及食管癌組織中高表達(dá)，且與患者的預(yù)后不良有關(guān)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，M2型TAM高表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌患者淋巴血管生成和微轉(zhuǎn)移，且其在腫瘤組織中浸潤與低生存率明顯相關(guān)[13]。CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞均為M2型TAM的表型，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了其在胰腺癌組織中的浸潤，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及不同CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平患者之間預(yù)后的差異，以期為胰腺癌的分子靶向治療及預(yù)后判斷提供參考。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中的CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)數(shù)目多于癌旁組織(P<0.05)，提示胰腺癌組織中存在M2型TAM浸潤。此外，本研究結(jié)果還提示CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞在胰腺癌的發(fā)生、進(jìn)展中可能起著重要作用。有研究顯示，CD163+在結(jié)直腸癌組織中浸潤，且與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[14]。本研究進(jìn)一步采用非條件Logistic回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胰腺癌組織中CD163+巨噬細(xì)胞表達(dá)的危險因素，TNM分期是胰腺癌組織中CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)的危險因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與多種腫瘤的預(yù)后不良關(guān)系密切，TNM分期越高表示腫瘤發(fā)展越接近中晚期，而相應(yīng)的CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)陽性率越高，提示CD163+、CD204+可作為評估胰腺癌預(yù)后的候選指標(biāo)，同時靶向耗損其在腫瘤組織中的浸潤及其功能，將會是治療胰腺癌的有效方法[14]。本研究進(jìn)一步觀察了不同CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞表達(dá)水平患者總生存期之間的差異，發(fā)現(xiàn)CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞高表達(dá)患者的總生存率均明顯低于低表達(dá)患者(P<0.05)，提示兩者高表達(dá)與患者的生存時間存在聯(lián)系。有研究顯示，M2型TAM高浸潤與患者的低生存率明顯相關(guān)[15]，這與本研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，胰腺癌患者腫瘤組織中存在CD163+、CD204+巨噬細(xì)胞浸潤，且分別與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期關(guān)系密切，檢測其表達(dá)水平對于評估胰腺癌的進(jìn)展和預(yù)后具有一定參考價值。