鄭曉東 綜述 馬德奎 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)：女性乳腺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中排第二(208.9萬)，僅次于肺癌(209.4萬)，是女性發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤(62.7萬)[1]。近年來，人們結(jié)合大量的流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)乳腺癌的分子原因與人類晝夜節(jié)律失調(diào)相關(guān)[2]。目前研究表明晝夜節(jié)律是由至少14 種核心生物鐘基因呈晝夜節(jié)律性表達所致，包括PER-1、PER-2、PER-3、Clock、CRY1、CRY2、ARNTL 或BMAL1、TIM、ROR、NPAS2、NR1D1 和NR1D2、CSNK1E，這些基因存在于下丘腦的視交叉上核SCN(suprachiasmatic nucleus)中，在外周組織中也有表達[3]，組成了轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路[4]。其中Bmal1/Clock異源二聚體激活Per(1-3)和Cry(1、2)基因，然后Per/Cry復(fù)合物在細胞質(zhì)中積聚后，重新定位到細胞核中，使Clock/Bmal1 反式激活失活下調(diào)其自身的表達，從而以24 h 為一個周期的表達形式控制著生物節(jié)律[5]。本文就生物節(jié)律中的核心基因Period基因與乳腺癌的關(guān)系進行綜述。

1 Period基因的概述

1.1 Per 基因的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu) KONOPKA 等[6]于1971 年在果蠅的X 染色體中發(fā)現(xiàn)了Per (PerO、PerL、PerS)基因，而這3個基因的突變都會對果蠅晝夜節(jié)律有極大的影響。隨后，在鼠和人中也發(fā)現(xiàn)了類似果蠅的Per 基因，并且存在Per1、Per2、Per3 三種基因型，在SCN、腦和外周組織中均有表達，是哺乳動物生命活動中的分子中心節(jié)律振蕩器和外周節(jié)律振蕩器的重要元件，它們在表達的部位和時相上存在差異。人類Per1 基因在中樞表達，Per2 基因在中樞和外周組織都有表達，Per3 基因只在胚胎期有表達[7]。Per1 基因位于染色體17p13.1p12 上，編碼含1 290 個氨基酸，分子質(zhì)量為136 KD的蛋白；Per1基因包含一個bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域和一個PTD 區(qū)域。Per2 基因位于染色體2q37.3 上，基因長度為51 529 bp，mRNA 長6 342 bp，包含了23 個外顯子，它的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生含1 246 個氨基酸的Per2 蛋白，后者包含兩PAS-A 和PAS-B 兩個區(qū)域[8]。Per3 基因位于染色體1p36 上，基因長度為60 475 bp，mRNA 長6 203 bp，共有21 個外顯子，編碼1 201 個氨基酸。在第18 個外顯子區(qū)域存在4 個或5個串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)，每個VNTR 編碼18 個氨基酸，這被稱為Per3基因的多態(tài)性[9]。

1.2 Per基因的功能 在哺乳動物的生物節(jié)律調(diào)節(jié)中，Per 基因(至少是Per1 和Per2)起著核心的作用。實驗中發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Per 基因后其日節(jié)律異常，但只要Per1、Per2 基因存在便能保持日節(jié)律，而Per3基因被破壞的小鼠，其日節(jié)律并不會出現(xiàn)紊亂，從而推斷Per3 基因可能不是維持日節(jié)律環(huán)路所必需的[10]。另一方面，因為Per 基因可以下調(diào)CyclinD1、C-myc、Wee1 等細胞周期蛋白而導(dǎo)致細胞周期由G1→S 或G2→M的進程受抑制從而調(diào)控細胞周期[11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)基因損傷因素如放射線、細胞毒性藥物等，能誘導(dǎo)生物鐘基因Per 表達上調(diào)從而促進DNA 損傷修復(fù)[12]。而Per3基因中VNTR多態(tài)性與一系列睡眠和晝夜節(jié)律特征相關(guān)，包括時間類型、每日社交和活動節(jié)律的穩(wěn)定性、總睡眠時間和“深度”非快速眼動睡眠的量等有關(guān)[9]。正是因為Per基因在控制生物節(jié)律、細胞周期和促進損傷修復(fù)等方面有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，所以當(dāng)Per基因表達異常時可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

2 晝夜節(jié)律與乳腺癌

2.1 晝夜節(jié)律與乳腺癌的流行病學(xué)關(guān)系 目前許多研究已經(jīng)證實了夜班工作和癌癥之間的潛在聯(lián)系，特別是護理或服務(wù)人員晝夜顛倒排班與乳腺癌發(fā)病率的研究數(shù)據(jù)更能體現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂與乳腺癌的關(guān)系。丹麥的一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)輪班工作的服務(wù)職業(yè)女性患乳腺癌的風(fēng)險增加，其危險相關(guān)(OR=1.5，95%CI=1.2～1.7)[13]。國內(nèi)研究表明[14]夜間工作與乳腺癌風(fēng)險增加相關(guān)(RR=1.20，95%CI=1.08～1.33)，無論是病例對照研究(RR=1.32，95%CI=1.17～1.50)還是隊列研究(RR=1.08，95%CI=0.97～1.21)均顯示夜間工作與乳腺癌風(fēng)險呈正相關(guān)。法國學(xué)者在2005 至2008年期間開展了一項以人群為基礎(chǔ)的大規(guī)模病例對照研究，其結(jié)果顯示首次懷孕就開始上夜班的女性患乳腺癌的幾率更高[15]。此外，2017年發(fā)表的一項隨訪超過22 年的前瞻性研究顯示，對整個美國連續(xù)的局域網(wǎng)環(huán)境進行了時變的客觀測量，發(fā)現(xiàn)生活在室外局域網(wǎng)水平高的地區(qū)的婦女侵襲性乳腺癌風(fēng)險增加了14%[16]。所有這些流行病學(xué)研究都有力地表明晝夜節(jié)律的紊亂會增加患癌癥的風(fēng)險。

2.2 生物鐘基因Per在乳腺癌中的表達情況及特征 不少研究證實了Per基因在各種癌癥中出現(xiàn)異常表達的情況，并且在某些腫瘤中Per基因的表達下調(diào)往往預(yù)示著腫瘤具有更高的惡性程度，從而推測Per基因可能是抑癌基因。包括在非小細胞肺癌(NSCLC)[17]、腹部惡性腫瘤[18]等組織中，對腫瘤組織與鄰近正常組織比較時Per 基因均出現(xiàn)低表達的情況。臺灣學(xué)者CHEN等[19]用免疫組織化學(xué)染色方法分析了55例臺灣女性乳腺癌患者中的Per 基因(Per1、Per2、Per3)，發(fā)現(xiàn)與鄰近的非癌細胞相比，乳腺癌細胞中的三種Per 基因有超過95%的表達受到干擾。國內(nèi)張寅斌等[20]取60例手術(shù)切除或活檢乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者癌組織和癌旁組織，分別用免疫組織化學(xué)染色方法檢測Per1、Per2基因蛋白表達，與病理和臨床結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示Per1、Per2 基因在乳腺癌細胞和癌旁組織中陽性表達率有顯著差異(P＜0.01)。乳腺癌Per1蛋白表達和ER、PR、c-erbB2 表達、組織分級有顯著相關(guān)性；而Per2蛋白的表達與c-erbB2、組織分級有顯著相關(guān)性，證明了Per1、Per2基因表達缺失和乳腺癌發(fā)生有關(guān)，在乳腺癌發(fā)生過程中具有重要作用。LESICKA等[21]利用實時定量PCR技術(shù)對107例新診斷乳腺癌患者的腫瘤組織和正常組織進行了Per基因(Per1、Per2、Per3)表達的分析，與非腫瘤標本相比，Per1(P＜0.000 1)、Per2(P=0.037)、Per3 (P=0.001)的mRNA 水平顯著降低；在ER/PR陰性的乳腺腫瘤中Per1、Per2基因的表達明顯低于ER/PR陽性的乳腺腫瘤。目前關(guān)于Per基因在乳腺癌中的表達研究與其在大部分癌癥中的表達相比無明顯差異，均顯示Per基因出現(xiàn)低表達的情況。

3 Period基因抑制乳腺癌的機制

3.1 啟動子甲基化 關(guān)于Per基因在乳腺癌中出現(xiàn)低表達的機制，Per基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)備受關(guān)注。SAMULIN等[22]已經(jīng)證明，在日夜顛倒工作者中的乳腺癌患者生物鐘基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生了變化，包括與對照組相比Per1基因的啟動子區(qū)甲基化水平升高。CHEN等[19]的研究首先揭示了Per基因的去調(diào)控不是由基因突變引起的，而是由Per1或Per2基因啟動子甲基化引起的，且Per1 基因啟動子甲基化與c-erbB2 表達密切相關(guān)(P=0.017)。KUO 等[23]的研究也證實了Per1、Per2基因在乳腺癌中啟動子發(fā)生高甲基化的觀點，并發(fā)現(xiàn)Per1啟動子甲基化與≥2+的c-erbB2免疫組化反應(yīng)相關(guān)(P=0.012)，與雌激素受體陽性呈強負相關(guān)(P=0.016)。LESICKA等[24]最新的研究發(fā)現(xiàn)從乳腺癌患者中分離的基因組DNA中，Per3(19.23%)和Per2(2.38%)的啟動子甲基化百分比最高，其次是Per1(1.51%)，且Per因啟動子區(qū)甲基化水平的升高與乳腺癌的分子亞型、組織學(xué)亞型和腫瘤分級之間存在關(guān)聯(lián)。

3.2 抑制增殖 目前的研究發(fā)現(xiàn)Per 基因?qū)毎芷趪烂艿恼{(diào)控作用，正常細胞周期是在Cyclins-CDKs-CKIs 細胞周期分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的精確調(diào)控下按嚴格的時間順序沿著G1-S-G2-M時相運轉(zhuǎn)[25]，管理G2/M 進展的Cdc2-cyclin B1 復(fù)合物受到CDC25磷酸酶的正調(diào)控，而受Wee1 和Myt1 激酶的負調(diào)控。GREY 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)Per1 基因受抑制可以降低CyclinB1、Cdc2和上調(diào)Wee1的水平，可能是通過上調(diào)抑癌基因p53 途徑進行調(diào)節(jié)的，從而使癌細胞停滯在G1、G2期。Per2基因過表達以后一方面顯著下降了正向周期調(diào)控蛋白C-myc、Cyclins 的表達，使得腫瘤細胞在G1期阻滯；同時也會直接上調(diào)Wee1 的表達或者通過上調(diào)p53 抑制CyclinB1 的表達，從而使癌細胞停滯在G2期[27,28]。Per1、Per2 基因通過這種阻滯細胞周期的作用抑制乳腺癌細胞的增殖。

3.3 促進凋亡 另一方面，Per基因的表達失調(diào)影響乳腺癌的發(fā)生是由于參與基因修復(fù)的調(diào)節(jié)作用。Per1、Per2基因包含在DNA損傷通路中，Per蛋白能夠與ATM(ataxia telangiectasia mutated gene)和Chk2激酶的磷酸化及非磷酸化形式結(jié)合，參與ATM→Chk2 DNA損傷信號通路，通過激活抑癌基因p53可以誘導(dǎo)細胞短暫停滯在G1期，從而使細胞有時間修復(fù)受損的DNA。不能修復(fù)的則通過上調(diào)c-Myc 抑制p53 誘導(dǎo)的p21Waf1/Cip1的表達來促進細胞凋亡或者由p53直接與BCL-2家族成員促進線粒體的細胞透化作用促進癌細胞凋亡[26,29-31]。也有研究表明用Period3基因可以直接激活Chk2 蛋白損傷修復(fù)過程；另外，由于Per1 和Per3蛋白的核定位需要兩者的二聚化同時作用，因此Per3 的低表達可能阻止Per1 蛋白的核輸入來抑制檢查點的激活，在這兩個層面參與到了乳腺癌的抑制中來[32]。

4 Period基因與乳腺癌的生物時辰治療

目前惡性腫瘤的治療主要以放化療為主，而無論是化療還是放療都不可避免給患者帶來巨大的毒副作用。因腫瘤細胞的生長依靠細胞周期轉(zhuǎn)化，也與晝夜節(jié)律有關(guān)[33]，自HRUSHESKY 等[34]率先運用阿霉素和順鉑對卵巢癌進行特定時間的時辰治療以來，各項研究對不同系統(tǒng)的腫瘤聯(lián)合時辰放化療都獲得較好的臨床收益[35]?？赏茰y對細胞周期調(diào)控起重要調(diào)控作用的Per基因在時辰治療中或?qū)⒊蔀榫薮蟮陌l(fā)現(xiàn)。且國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)對乳腺癌行聯(lián)合時辰化療與常規(guī)化療比，具有療效高、副作用低的優(yōu)點，值得臨床推廣應(yīng)用[36]。但腫瘤的時辰治療仍處于初期，臨床治療效果的獲益性與Per基因的時間性表達相關(guān)性仍需進一步研究探索。

5 展望

Per基因在生物節(jié)律、細胞周期、惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。雖然不少研究發(fā)現(xiàn)Per基因在乳腺癌組織和癌旁非癌組織中的表達有差異并影響著預(yù)后，但如何將Per基因的生物學(xué)功能更好地用于乳腺癌的臨床治療尚有許多問題需要解決。隨著研究數(shù)據(jù)的不斷累積和豐富，期望臨床能夠闡明Per基因與乳腺癌的聯(lián)系，將有利于乳腺癌新治療策略的發(fā)展，并為指導(dǎo)時辰治療、評估疾病預(yù)后等提供依據(jù)。