切片厚度和烘干溫度對唐古特大黃蒽醌含量影響的研究

劉何春，姚小波，雷雪萍，周國英，聶秀青，熊 豐

1中國科學(xué)院西北高原生物研究所 藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；2西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，拉薩 850032；3青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008

蓼科(Polygonaceae)大黃屬(RheumLinn.)植物唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.又名雞爪大黃、Jun Muzha(藏藥名)，是青藏高原獨(dú)有的中藥材和藏藥材。生境在海拔高度2 300～4 200米的森林邊緣、溝壑灌木及草地，分布于西藏東北部、青海東北部、甘肅南部、川西北部等[1- 3]。青藏高原的氣候和地理特征，如海拔高、輻射強(qiáng)、積溫少、晝夜溫差大，造就了唐古特大黃獨(dú)特的品質(zhì)[2]。它的活性成分中主要包括大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素、大黃酸等在內(nèi)的蒽醌類衍生物，這些成分的作用包括強(qiáng)致瀉，對病源微生物有抗性、鎮(zhèn)痛和抵抗炎癥、保肝和利膽、調(diào)節(jié)免疫[4]。

中藏藥種類繁多，加工方法因產(chǎn)地而異。不同的炮制、加工方法對中藏藥材的成分及功效也有明顯的影響，由此造成藥材質(zhì)量的不穩(wěn)定性[5]。中藏藥更注重來源和原產(chǎn)地加工方法，切片是加工根莖類藥材最主要的方法：對于質(zhì)地堅(jiān)硬且不易干燥的粗大根莖藥材，收獲后應(yīng)立即去除殘留的莖和須，新鮮的根莖應(yīng)用某些工具切制成固定的形狀[6]?！吨袊幍洹?2015年版)大黃項(xiàng)下的描述，沒有對加工方法做明確要求；甘肅省地方標(biāo)準(zhǔn) 《無公害中草藥- 大黃生產(chǎn)技術(shù)》中，對掌葉大黃各種加工規(guī)格做了相關(guān)規(guī)定，但也僅僅限于一些感官指標(biāo)，對于其有效成分的含量要求并沒有具體說明。目前對于蓼科大黃屬植物藥材大黃的產(chǎn)地加工報(bào)道僅限于甘肅省產(chǎn)區(qū)對于掌葉大黃的切制、干燥等加工方法的探討[7- 11]，關(guān)于唐古特大黃切片加工的報(bào)道很少。 因此，加強(qiáng)藥材切制方面的研究，加以在藥材產(chǎn)地逐步推廣，對于提高藥材飲片的質(zhì)量，具有十分重要的意義[12- 15]。

本文作者采用的是HPLC- DAD法，研究了唐古特大黃在不同烘干溫度下，不同的切片厚度對于蒽醌含量的影響，目的在于完善唐古特大黃的加工工藝。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所用的大黃藥材樣本采自青海省西寧市湟中縣攔隆口鎮(zhèn)，采挖時(shí)間為2012年10月，藥材的生長年限為6年。根莖部洗凈、去皮，趁鮮按照0.4、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 cm梯度厚度切片，分別置于25、50、75 ℃烘干，粉碎備用。

1.2 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀Agilent1200型，包括脫氣裝置G1322A型、四元泵G1311A型、標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器G1329A型、柱溫箱G1316A型、二極管陣列檢測器G1315D型。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N- 1001D- WD型。

試劑：實(shí)驗(yàn)室自制HPLC級超純水；氯仿、鹽酸、冰乙酸、分析級甲醇等有機(jī)溶劑；色譜級別甲醇；對照品包括：批號110795- 201007蘆薈大黃素、批號110757- 200206大黃酸、批號110756- 200110大黃素、批號110758- 201013大黃素甲醚和批號：110796- 201118大黃酚，購買于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 色譜分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱采用的是Agilent Eclipse plus C18柱(4.6×250 mm，5 μm)(反向C18是色譜柱填料)。體積流量1.000 mL/min。色譜甲醇作為流動相A，0.1%冰乙酸溶液作為流動相B；0～20 min，60%～80% A；20～40 min，80%～95% A；40～45 min，95% A作為梯度洗脫程序。25 ℃作為色譜柱柱溫，254 nm作為本次試驗(yàn)檢測波長。

1.3.2 制備本試驗(yàn)的對照品溶液和供試品溶液

精密稱取對照品大黃酚0.55 mg、大黃素甲醚1.24 mg、大黃素1.12 mg、大黃酸0.60 mg、蘆薈大黃素1.10 mg，使用甲醇將其分別溶解，并定容至25 mL的容量瓶中，制成含22 μg/mL大黃酚、49.6 μg/mL大黃素甲醚、44.8 μg/mL大黃素、24 μg/mL大黃酸、44 μg/mL蘆薈大黃素的對照品溶液。

稱重約0.150 g本品粉末(通過四號篩)，準(zhǔn)確稱重，將其置于帶塞的錐形瓶中，并準(zhǔn)確加入25 mL的甲醇，稱定其重量，加熱回流1 h，放至其冷卻，再次稱重量，并用甲醇溶液補(bǔ)足在回流過程中由于蒸發(fā)損失的量，搖勻并過濾。量取5 mL續(xù)濾液，放置于燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中揮去溶劑，加入10 mL 8%鹽酸溶液，在220 W、40 kHz、30 ℃下超聲處理2 min，再加10 mL氯仿，加熱回流1 h，放置至冷卻，分離氯仿層，用氯仿萃取酸性溶液三次，每次10 mL，合并氯仿溶液，并在減壓條件下將回收溶液恢復(fù)至干燥，甲醇溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移到10 mL量瓶中，將續(xù)濾液取出，通過0.45 μm濾孔的微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.3.3 方法學(xué)考察[14,15]

方法學(xué)考察內(nèi)容包括：回歸方程繪制、穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)。結(jié)果分別表明：對照品在24小時(shí)內(nèi)和5天內(nèi)穩(wěn)定性良好，儀器和進(jìn)樣精密度良好，重復(fù)性良好，回收率良好。

表1 蒽醌方法學(xué)指標(biāo)

1.3.4 樣品測定

精密稱量樣品粉末約0.150 g，制備供試液，注入液相色譜儀Agilent1200型，并將每批次平行測量三次，記錄色譜圖的峰面積，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線測算含量。樣品色譜圖和混合對照品如圖1所示。

圖1 混合對照品(左)和樣品(右)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram mixed standard(Left)and sample(Right) 注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃素甲醚；5.大黃酚。Note：1.Aloe emodin；2.Rhein acid；3.Emodin；4.Physcion；5 Chrysophanol.

2 結(jié)果與分析

2.1 五種蒽醌成分含量測定結(jié)果

2.1.1 蘆薈大黃素成分含量測定結(jié)果

在不同烘干溫度下的不同切片厚度唐古特大黃蘆薈大黃素含量如表2所示。在相同溫度下，唐古特大黃蘆薈大黃素含量的變化隨切片厚度增加呈雙峰變化。在25 ℃，厚度3 cm，50、75 ℃，厚度2 cm出現(xiàn)第1個(gè)峰值。此后蘆薈大黃素含量隨著厚度的增加而下降。溫度為25、50 ℃，厚度5cm，75 ℃，厚度4 cm時(shí)蘆薈大黃素含量達(dá)最低值。在25、50 ℃，厚度8 cm，75 ℃，厚度5～7 cm時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)峰值。

蘆薈大黃素有抗菌、瀉下的功效，以其為主要成分入藥的話，建議低溫烘干時(shí)切片6～9 cm或0.4～3 cm；中溫烘干時(shí)切片6～8 cm或0.4～3 cm；高溫烘干時(shí)切片5～7 cm或0.4～3 cm。

數(shù)據(jù)分析由SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包中的one- way ANONA模塊進(jìn)行，95%置信區(qū)間。

2.1.2 大黃酸成分含量測定結(jié)果

不同切片厚度唐古特大黃藥材在不同烘干溫度下大黃酸含量如表3所示。在相同溫度下，唐古特大黃大黃酸含量的變化隨切片厚度增加呈w型變化。三種溫度下的大黃酸含量的第一個(gè)峰值出現(xiàn)在0.4 cm時(shí)。低、中、高溫下分別在4、3、2 cm時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)峰值。中低溫下在8 cm，高溫下在7 cm含量達(dá)到第三個(gè)峰值。

表2 不同切片厚度和不同溫度下唐古特大黃中蘆薈大黃素含量(n=5)

注：含量=均值±標(biāo)準(zhǔn)差；表中的不同字母表示差異顯著，相同的字母表示差異不顯著。下表同。

Note:Content = mean ± standard deviation;The different letters in the table indicate significant differences,and the same letters indicate that the differences are not significant.The table below is the same.

大黃酸有抗菌、抗癌、導(dǎo)瀉、利尿的功效，以其為主要成分入藥的話，建議中、低溫下切片厚度6～8 cm；高溫下切片厚度0.4～2 cm或7 cm。

表3 唐古特大黃藥材不同切片厚度大黃酸含量的測定結(jié)果(n=5)

注：含量=均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.1.3 大黃素成分含量測定結(jié)果

不同切片厚度唐古特大黃藥材中大黃素含量如表4所示。在相同溫度下，唐古特大黃大黃素含量的變化隨切片厚度增加同樣呈雙峰變化。25 ℃、3 cm時(shí)，50 ℃和75 ℃、2 cm時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)峰值。此后大黃素含量隨著厚度的增加而下降，25 ℃、50 ℃、5 cm時(shí)，75 ℃、4 cm時(shí)大黃素含量達(dá)最低值。25 ℃、75 ℃、7 cm時(shí)，50 ℃、8 cm出現(xiàn)第二個(gè)峰值。

大黃素的功效諸如抗菌、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤、抗痙攣、抗高血壓、利尿等，以其為主要成分入藥的話，建議采用高溫烘干且切片厚度2 cm或6～7 cm；或在中溫下烘干，切片8 cm；或在低溫下烘干，切片0.4～3 cm。

表4 唐古特大黃藥材不同切片厚度大黃素含量的測定結(jié)果(n=5)

注：含量=均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.1.4 大黃素甲醚成分含量測定結(jié)果

唐古特大黃藥材在不同切片厚度的情況下，大黃素甲醚含量如表5所示。在相同溫度下，唐古特大黃大黃素甲醚含量的變化隨切片厚度增加呈雙峰變化。25 ℃和50 ℃的第一個(gè)峰值出現(xiàn)在3 cm時(shí)，75 ℃出現(xiàn)在2 cm時(shí)。之后，大黃素甲醚的含量隨厚度的增加而降低，溫度為25 ℃，厚度5 cm；50、75 ℃，厚度4 cm時(shí)含量達(dá)最低值。25 ℃和75 ℃的第二個(gè)峰值出現(xiàn)在7 cm時(shí)，50 ℃出現(xiàn)在8 cm時(shí)。

大黃素甲醚體外抗菌作用顯著，若取其為主要成分入藥的話，建議高溫下烘干厚度控制在2 cm或6～7 cm；中溫下烘干含量較低，但是建議切片8 cm；低溫下烘干建議切制0.4～3 cm。

表5 唐古特大黃藥材不同切片厚度大黃素甲醚含量的測定結(jié)果(n=5)

注：含量=均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.1.5 大黃酚成分含量測定結(jié)果

不同切片厚度唐古特大黃大黃酚含量如表6所示。在相同溫度下，唐古特大黃大黃酚含量的變化隨切片厚度的增加也呈現(xiàn)出雙峰變化。25 ℃、50 ℃在3 cm時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)高峰，75 ℃是在2 cm時(shí)。此后大黃酚含量隨著厚度的增加而下降，25 ℃、5 cm，50 ℃、6 cm，75 ℃、4 cm時(shí)含量達(dá)最低值。25 ℃、75 ℃下在7 cm時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)高峰，50 ℃在8 cm時(shí)。

大黃酚的功效諸如鎮(zhèn)咳、抗菌、利尿、促腸管蠕動、神經(jīng)刺激和肌肉麻痹等，若取其為主要成分入藥的話，建議高溫下烘干切片2 cm或6～7 cm；中溫下烘干切片0.4～3 cm或8 cm；低溫下烘干含量較低，不宜采用。

表6 唐古特大黃藥材不同切片厚度大黃酚含量的測定結(jié)果(n=5)

注：含量=均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:Content = mean ± standard deviation.

2.2 總蒽醌含量測定結(jié)果

在不同烘干溫度下，不同切片厚度唐古特大黃藥材總蒽醌含量如表7所示。在相同溫度下，唐古特大黃總蒽醌含量隨切片厚度增加呈雙峰變化，同單項(xiàng)蒽醌含量變化表現(xiàn)出基本一致的變化規(guī)律。25和50 ℃時(shí)總蒽醌含量第一個(gè)峰值出現(xiàn)在厚度3 cm，75 ℃時(shí)第一個(gè)峰值出現(xiàn)在厚度2 cm。此后，總蒽醌含量隨著厚度的增加而下降，溫度25 ℃和50 ℃，厚度5 cm；75 ℃，厚度4 cm時(shí)總蒽醌含量降至最低。然后，隨著厚度的增加，三個(gè)溫度下的含量都隨之升高，25 ℃和75 ℃，厚度7 cm；50 ℃，厚度8 cm時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)峰值。

唐古特大黃在不同溫度25、50、75 ℃烘干條件下，總蒽醌含量隨切片厚度的變化規(guī)律是一致的。

5種蒽醌的含量：大黃酸>大黃素甲醚>大黃酚>蘆薈大黃素>大黃素。

比較25、50、75 ℃烘干時(shí)不同切片厚度總蒽醌的含量，75 ℃烘干時(shí)，切片2 cm和7 cm時(shí)總蒽醌含量最高，但耗能較大。25 ℃時(shí)總蒽醌含量較75 ℃稍低，25 ℃烘干耗能最低。綜上所述，唐古特大黃產(chǎn)地加工，烘干溫度25 ℃和50 ℃時(shí)0.4～3 cm以及6～8 cm，或75 ℃時(shí)切片厚度0.4～2 cm以及6～7 cm，蒽醌含量最高。

表7 唐古特大黃藥材在不同切片厚度和不同烘干溫度時(shí)總蒽醌含量(n=5)

注：含量=均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note： Content = mean ± standard deviation.

圖2 不同厚度、不同烘干溫度唐古特大黃藥材的總蒽醌含量示意圖Fig.2 The content of anthraquinone derivatives under different thickness of R.tanguticum

3 討論

《中國藥典》(2015年版)規(guī)定：按干燥品計(jì)算，大黃藥材中含大黃素甲醚、大黃酚、大黃素、大黃酸以及蘆薈大黃素的總量不得少于1.5%。由表7可見，本實(shí)驗(yàn)所采藥材唐古特大黃所含蒽醌總量均高于藥典規(guī)定，且部分切片厚度的總蒽醌含量高達(dá)藥典規(guī)定的2～3倍，這也充分證明了青海省唐古特大黃藥材的優(yōu)質(zhì)和道地性。

新鮮中、藏藥材在原產(chǎn)地就趁鮮切制成片，不僅縮短了加工環(huán)節(jié)，節(jié)約了能源，而且保持了良好的色澤和氣味[6]?！吨袊幍洹逢P(guān)于大黃“刮去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥”的加工規(guī)定，表述模糊或不確定性高[1,14,15]。近年來甘肅大黃藥材產(chǎn)區(qū)，在繼承傳統(tǒng)加工方法的基礎(chǔ)上，重視大黃產(chǎn)地加工方法的研究，把甘肅種植掌葉大黃做為研究對象，采用現(xiàn)代設(shè)備在切制、干燥等加工方法進(jìn)行探討[7- 11,14,15]。切制方面，對于大黃切片厚度的研究，Song[7]、Li[8]曾以2～4 mm的厚度進(jìn)行研究；Dai[ 9]、Tang[10]曾以2～3 cm的厚度對其研究；其他或切長條5 cm[9]或采用傳統(tǒng)加工方法——藥材不切片僅將體積特別大的主根截成長約10～13 cm段或者縱剖為兩半[1]、或分薄中厚切片研究[11]。得出的結(jié)論也不盡相同，如Xu[11]在不同切制條件對掌葉大黃的影響中得出的結(jié)論是薄片和中片較好，但是薄片和中片范圍模糊，產(chǎn)地加工時(shí)難以界定和操作。參照上述研究，除Tang[10]和Xu[11]對掌葉大黃的加工有稍微明確的加工條件外，其他的研究結(jié)果并不明確。由于掌葉大黃和唐古特大黃的產(chǎn)地和品質(zhì)的不同，掌葉大黃的加工方法并不一定適用唐古特大黃。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對唐古特大黃加工時(shí)建議，烘干溫度25和50 ℃時(shí)0.4～3 cm以及6～8 cm，或75 ℃切片厚度0.4～2 cm以及6～7 cm，蒽醌含量最高。在實(shí)際的加工生產(chǎn)過程中，根莖類藥材飲片加工既包括切片也包括切段：如果切片，即0.4～3 cm是推薦厚度；如果切段，則6～8 cm是推薦厚度。藥材的產(chǎn)地加工需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以確保產(chǎn)品質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求。不同切片厚度結(jié)合高中低三種烘干溫度，總蒽醌和五種蒽醌的含量及變化趨勢呈現(xiàn)出了一定的相似性，總蒽醌和五種蒽醌相互證實(shí)，證明了規(guī)律的可信度。