王 昱，何九軍，張宗舟

隴南師范高等專科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院 隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，成縣 742500

人體衰老是一個全方位、多因素、系統(tǒng)的不可逆的過程，常伴隨著結(jié)構(gòu)的退行性變和機(jī)能的衰退。皮膚的衰老則表現(xiàn)為皮膚變薄、彈性減退、皺紋出現(xiàn)、干燥粗糙、色素沉著、血管突顯等臨床癥狀[1]。目前文獻(xiàn)報道，皮膚的衰老與氧自由基損傷、免疫力衰退、端粒酶活性降低、炎性浸潤等有關(guān)[2,3]。在延緩皮膚衰老的方面，外科手術(shù)運(yùn)用皮膚提緊術(shù)、肉毒素注射、膠原皮下注射等方法治療，但有一定的風(fēng)險及副作用。中醫(yī)從疏通經(jīng)絡(luò)氣血、調(diào)整臟腑功能等入手[4]，是治療皮膚衰老的有效方法之一。所以，將傳統(tǒng)中醫(yī)藥的抗衰防老手段與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)用于皮膚保健及抗衰老的功能性食品是當(dāng)前重要的課題。

肉靈芝學(xué)名太歲，《本草綱目》記載肉靈芝既可食用，也可入藥，有“輕身不老、延年神仙”功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》也提到肉靈芝無毒，能補(bǔ)中益氣、增智慧[5]。近年來的研究表明，肉靈芝有效成分包括吡咯喹啉醌、氨基酸、維生素、微量元素等，對高血壓、動脈硬化、癌癥、風(fēng)濕病等有一定作用，是一種高蛋白、低脂肪、具有豐富的鈣、鐵、鋅等微量元素的生物體[6]。Xiong等[7]研究表明肉靈芝中的生物活性成分穩(wěn)定性高且易通過機(jī)體血腦屏障，能促進(jìn)新生神經(jīng)元的發(fā)生，在治療神經(jīng)退行性疾病中具有更為廣闊的前景。為了進(jìn)一步探討GLAE的藥用和保健作用，本研究運(yùn)用生物顯微技術(shù)、彗星電泳、定量PCR等技術(shù)對GLAE的抗衰老作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 白肉靈芝水提物制備

取本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的白肉靈芝，烘干(35 ℃)子實(shí)體，提取DNA后擴(kuò)增、電泳檢測、條帶純化、測序(上海生物工程有限公司)。鑒定結(jié)果表明該樣本為白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]，將白肉靈芝子實(shí)體干品粉碎，過篩(60 目)、提取(96 ℃水浴)、離心，收集上清，過濾，濾液冷凍干燥，得到白肉靈芝水提物。

1.2 動物模型建立與給藥

50只健康SD大鼠，雌雄各半，許可證號：SCXK(甘)2005-0007，體質(zhì)量200～250 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為5組，每組10只：對照組、模型組、GLAE低劑量組、GLAE中劑量組和GLAE高劑量組。模型組和GLAE組大鼠采用頸背部皮下注射D-半乳糖(北京優(yōu)尼康生物科技，批號MG05201)溶液300 mg/kg·bw[3]，同時GLAE低、中、高劑量組分別灌胃(50、100 和200 mg /kg·bw)的GLAE[8]，對照組每天注射等量的0.9% 生理鹽水，連續(xù)處理7周。

1.3 組織學(xué)觀察

采用頸椎脫臼法處死大鼠，用 8%硫化鈉溶液脫毛后立即取大鼠背部正中皮膚修成常規(guī)大小，經(jīng)4 %多聚甲醛液固定、石蠟包埋切片、染色后，顯微鏡觀察。

1.4 膠原蛋白含量的測定

取背部皮膚的真皮，在培養(yǎng)皿中用無血清HBSS液(Hanks平衡鹽緩沖溶液)沖洗，眼科剪剪碎，然后用彎頭吸管反復(fù)吹打，0.125%胰蛋白酶和 0.01%的EDTA室溫消化30 min，終止消化后棄去消化液，收集細(xì)胞按照ELISA檢測試劑盒(ELx800，美國BioTek公司)說明書操作，檢測Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白的含量。

1.5 彗星電泳檢測皮膚細(xì)胞DAN的損傷

根據(jù)文獻(xiàn)制片[9]：第一、二層分別鋪瓊脂糖和上述制備的細(xì)胞懸液。將制備好的載玻片置于4 ℃固定30 min 后，浸沒于4 ℃預(yù)冷的裂解液(2.5 M NaCl、100 mM Na2EDTA、10 mM Tris-HCl pH 10、1%肌氨酸鈉、1%Triton和1%DMSO)中裂解2 h。在4 ℃盛有堿性電泳緩沖液(1 mM EDTA，300 mM NaOH)的電泳槽(DYCPZ型，北京市六一儀器廠)靜 置20 min，使DNA 解旋，然后在25 V 電壓，300 mA 電流下電泳(DYY- IB型電泳儀，北京市六一儀器廠)20 min。Tris- HCl緩沖液(4 ℃)中和至中性，用溴化乙錠(廣州化學(xué)試劑廠)溶液染色30 s～1 min，蒸餾水洗滌。在倒置熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica)下用515～560 nm 的激發(fā)光觀察單細(xì)胞電泳圖像，每樣做3張片子，拍照觀察DNA損傷細(xì)胞(尾長大于頭部半徑的細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以彗星率%表示。

1.6 PCR檢測皮膚MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表達(dá)

取大鼠皮膚在2 mL 的離心管(加入1 mL Trizol)中反復(fù)研磨，離心(14 000 rpm)10 min，然后按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行酚- 氯仿抽提RNA、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，最后采用 ABI 7 500 軟件分析，用2-△△Ct方法進(jìn)行相對定量。(引物由上海涵悅生物科技有限公司設(shè)計，上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。Taka Ra公司提供RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、定量PCR試劑)。

表1 目的基因引物序列

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 GLAE對大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠皮膚組織分層清楚、結(jié)構(gòu)完整，真皮層的膠原纖維排列整齊、分布均勻，皮膚附屬器數(shù)量較多。模型組大鼠表皮變薄，結(jié)構(gòu)不完整，皮膚附屬器減少；真皮和皮下結(jié)締組織被致密、無彈性的纖維化組織所替代，皮膚纖維化嚴(yán)重。GLAE高劑量組大鼠皮膚組織形態(tài)接近對照組，表皮較厚，組織結(jié)構(gòu)完整，皮膚附屬器較多(見圖1)。

圖1 GLAE對大鼠皮膚組織病理學(xué)影響Fig.1 Effect of GLAE on the skin histopathology in rats注：A.對照組；B.模型組；C.GLAE高劑量組，標(biāo)尺示50 μm。Note:A.control group;B.model group;C.GLAE high- dose group,bar=50 μm.

2.2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量

與對照組相比，模型組成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，GLAE低、中、高劑量組成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量均呈升高趨勢(P<0.01，P<0.05)(見圖2)。

2.3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚細(xì)胞的DNA損傷

彗星電泳又稱單細(xì)胞凝膠電泳，若細(xì)胞核DNA斷裂成片段，在電泳條件下，其移動的速度快于細(xì)胞核部分，從而在電泳圖上形成彗星狀圖形，尾部的長短或面積大小代表細(xì)胞核DNA損傷的程度，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形(見圖3)。由圖4可知，各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚細(xì)胞的DNA均有不同程度斷裂，均出現(xiàn)了彗星狀圖形。與對照組相比，模型組大鼠皮膚細(xì)胞DNA的彗星率極顯著升高(P< 0.01)。與模型組相比，GLAE低、中、高劑量組大鼠皮膚的細(xì)胞DNA彗星率均呈降低趨勢(P< 0.05，P< 0.01)。

圖2 GLAE對大鼠皮膚Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量的影響Fig.2 Effects of GLAE on contents of skin typeⅠand type Ⅱ collagen in rats注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0.01)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P > 0.05)。Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05).

圖3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚細(xì)胞DNA的彗星電泳圖 Fig.3 Comet electrophoretogram of skin cell in each experimental group注：A.對照組；B.模型組；C.GLAE高劑量組，標(biāo)尺示20 μm。Note:A.control group;B.model group;C.GLAE high- dose group,bar=20 μm.

圖4 GLAE對大鼠皮膚細(xì)胞DNA損傷的影響 Fig.4 Effect of GLAE on skin cell DNA damage of rats注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0.01)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P > 0.05)。Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05).

2.4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚組織MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表達(dá)

由表2可知，與對照組相比，模型組大鼠皮膚組織MAP3K5和TGF-β1 mRNA表達(dá)量極顯著下降，PLOD2 mRNA表達(dá)量極顯著升高(P< 0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量組大鼠皮膚組織MAP3K5和TGF-β1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，PLOD2 mRNA表達(dá)量呈降低趨勢(P< 0.05，P< 0.01)。

表2 GLAE對大鼠皮膚組織MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表達(dá)的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P< 0.01)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P> 0.05)。

Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P< 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P> 0.05).

3 討論

皮膚衰老時表現(xiàn)出表皮變薄、膠原纖維排列紊亂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常等明顯的形態(tài)學(xué)變化[10,11]。人體皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白，其中的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白交織成網(wǎng)，支撐起整個皮膚，而當(dāng)膠原蛋白含量降低時，皮膚的彈力明顯下降[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠皮膚的各層組織間層次不清楚，表皮變薄，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量降低，DNA損傷加劇。而經(jīng)GLAE作用后，大鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮增厚，真皮內(nèi)膠原纖維增多，排列比較緊密、整齊，DNA損傷程度明顯降低，這表明GLAE對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護(hù)作用。

在生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育及維持機(jī)體細(xì)胞平衡中起到了重要的調(diào)控作用，確保細(xì)胞達(dá)到最佳平衡的狀態(tài)。在病理條件下，細(xì)胞凋亡會引起機(jī)體結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性改變，引發(fā)許多老年性疾病，即與皮膚衰老存在一定的關(guān)聯(lián)性[13]。MAP3K5 基因是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡必需基因，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，也可作為抑癌基因發(fā)揮促凋亡作用[14,15]。MAP3K5基因在皮膚中表達(dá)下調(diào)，皮膚細(xì)胞凋亡明顯加劇，導(dǎo)致皮膚病理改變[1]。因而，MAP3K5基因可能是抑制細(xì)胞凋亡、抗皮膚衰老的基因之一。轉(zhuǎn)化生長因子-βl(TGF-βl)是一種多效性、多功能性的高效生長分化因子，可以通過抑制膠原酶的活性來抑制基質(zhì)降解，促進(jìn)膠原合成[16]。研究表明，TGF-βl能促進(jìn)成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)起源細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成[17]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子和胰島素樣生長因子的水平與外源性的TGF-βl 呈正向關(guān)系[18]，成纖維細(xì)胞增殖活性率提高，I、II型膠原蛋白含量及其mRNA的表達(dá)增加，促進(jìn)真皮內(nèi)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)和重建[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠皮膚中基因MAP3K5表達(dá)顯著降低，經(jīng)GLAE作用后，衰老大鼠皮膚組織中基因MAP3K5、TGF-βl表達(dá)量顯著增加，提示GLAE可通過上調(diào)MAP3K5和TGF-βl基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，從而發(fā)揮延緩皮膚衰老的作用。

賴氨酸羥化酶(lysyl hydrxoylase, LH)與膠原蛋白的形成及穩(wěn)定有著密切的關(guān)系。LH 的主要功能是催化膠原蛋白分子中的賴氨酸羥化成羥賴氨酸，把膠原蛋白分子共價交鏈形成穩(wěn)定物，大量的膠原蛋白無法降解，過度堆積在機(jī)體組織中，從而使皮膚松弛、組織纖維化等衰老表現(xiàn)[20]。LH 家族中的 LH1、LH2、LH3 是分別由PLOD1、PLOD2、PLOD3 編碼的，其中的PLOD2 表達(dá)量增加時，LH2 活性增強(qiáng)，從而促使膠原纖維過度堆積聚集[21]。本研究結(jié)果表明，模型大鼠皮膚組織中 PLOD2 基因表達(dá)顯著增加，而經(jīng)GLAE作用后，其表達(dá)顯著下降，說明GLAE可通過下調(diào) PLOD2 的表達(dá)，降低 LH2 的活性，減少膠原蛋白在皮膚組織的堆積，在增加皮膚彈性和減少皮膚皺紋形成方面有重要作用。

綜上所述，GLAE對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護(hù)作用，這種作用可能與增加膠原蛋白含量、抑制皮膚細(xì)胞DNA損傷、調(diào)節(jié)MAP3K5、TGF-β1和PLOD2基因的表達(dá)有關(guān)。對于肉靈芝中有效生物成分的藥用價值，目前無完備的科學(xué)解釋，還需大量的藥理驗(yàn)證。