付旭陽(yáng)，高 麗，呂 宏，侯秋麗，陳金雙，孔令雷，石瑞麗

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040； 2.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014040；3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006； 4.廣東省人民醫(yī)院麻醉科，廣東省 廣州市 510080；5.內(nèi)蒙古監(jiān)獄管理局第一醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010000； 6.包頭醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040;7.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶標(biāo)研究與藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是病因尚未明確的、以侵蝕關(guān)節(jié)為主的全身性免疫疾病。臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)外病理性改變，逐漸出現(xiàn)骨組織的破壞與侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)不同程度的畸形。患者需要長(zhǎng)期服藥，藥物的副作用及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

蒙藥復(fù)方忠倫-5，別名合日呼-5湯、忠倫阿湯等，由苦參(SophoraFlavescensAit，SFA)、梔子(GardeniajasminoidesEllis，GJE)、川楝子(FructusToosendan，F(xiàn)T)、訶子(TerminaliachebulaRetz，TCR)、肋柱花(Lomatogoniumrotatum，LR)組成，出自蒙醫(yī)著作《觀者之喜》，具有清熱涼血、舒筋止痛功效，是蒙醫(yī)治療熱性黃水病、游痛證、痛風(fēng)、陳舊熱等疾病的常用方劑，傳統(tǒng)蒙醫(yī)臨床應(yīng)用本方治療RA[1]，能夠明顯改善RA患者的生活質(zhì)量，療效明確[2]。動(dòng)物試驗(yàn)中，忠倫-5對(duì)小鼠急性、亞急性和慢性炎癥，均有減輕炎性細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)的刺激作用[3]。

作為“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”的蒙醫(yī)學(xué)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展，形成了一個(gè)全面而獨(dú)特的醫(yī)學(xué)體系。然而，從分子水平來(lái)理解蒙藥方劑仍然是一大挑戰(zhàn)。隨著生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的飛速發(fā)展，“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”概念被提出，基于網(wǎng)絡(luò)的藥物研發(fā)成為一種新的高效可行的方法。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)橋接藥物和疾病，多方向、多角度地闡述藥物治療疾病的機(jī)制。已有研究證實(shí)了該方法的可行性[4-5]。為全面闡釋蒙藥忠倫-5的作用機(jī)制，本課題擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法全面地解析忠倫-5治療RA的機(jī)制，為傳統(tǒng)蒙藥的研發(fā)提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 忠倫-5成分信息及作用靶點(diǎn)的獲取登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[6](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，Version：2.3)和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)[7](http://www.megabionet.org/tcmid/，Version：2.0)獲得苦參、訶子、梔子、川楝子、肋柱花化合物信息，并以“經(jīng)口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18”為條件篩選化合物。將化合物的2D分子結(jié)構(gòu)式輸入到Swisstarget prediction數(shù)據(jù)庫(kù)[8](http://www.swisstargetprediction.ch)中，預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，保存靶點(diǎn)uniprot ID和名稱等信息。

1.2 RA相關(guān)靶點(diǎn)的獲得在DISGENET數(shù)據(jù)庫(kù)[9](http://www.disgenet.org/，version 5.0)中，以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，檢索與RA相關(guān)的靶點(diǎn)。刪除重復(fù)靶點(diǎn)并剔除相關(guān)性得分小于0.3的靶點(diǎn)，保留剩余靶點(diǎn)，與上述的忠倫-5靶點(diǎn)相匹配，得到忠倫-5治療RA的作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 VENNY圖的制作登錄Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將各單味藥及靶點(diǎn)輸入在表格中，得到VENNY圖，找到5種成分共同作用的靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白相關(guān)作用網(wǎng)路構(gòu)建分析將數(shù)據(jù)集的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[10](https://string-db.org/，Version 10.5)，種屬選擇“Homo sapiens”，獲得靶點(diǎn)間的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，下載相關(guān)數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Cytoscape(Version:3.2.1)軟件中，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)、拓?fù)浞治?，根?jù)自由度設(shè)置節(jié)點(diǎn)顏色及大小，構(gòu)建為蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物功能分析及參與通路獲得將忠倫-5治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用的靶點(diǎn)uniprot ID導(dǎo)入Cytoscape軟件的GO插件(Version:2.3.5)中，設(shè)置物種“Homo sapiens”選擇“GO分析、參與生物過(guò)程分析及KEGG通路分析”設(shè)置P值<0.05，提交獲得相關(guān)結(jié)果。

1.6 Hub節(jié)點(diǎn)選擇及分子對(duì)接驗(yàn)證應(yīng)用Cytoscape軟件的cytoHubba插件，cytoHubba應(yīng)用Maximal Clique Centrality(MCC)方法，綜合11個(gè)拓?fù)浞治龇椒?Degree，Edge Percolated Component，Maximum Neighborhood Component，Densityof Maximum Neighborhood Component，Maximal Clique Centrality)和6個(gè)中心性方法(Bottleneck，EcCentricity，Closeness，Radiality，Betweenness，and Stress)，選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)，找到作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)的活性成分，將成分及應(yīng)對(duì)的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入Systems Dock Web Site (http://systemsdock.unit.oist.jp，Version 2.0)進(jìn)行分子對(duì)接，保存結(jié)果，根據(jù)對(duì)接得分分析活性成分與各靶點(diǎn)間的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)集得到忠倫-5的潛在靶點(diǎn)，并將這些靶點(diǎn)與DISGENET數(shù)據(jù)庫(kù)中RA的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，交集為治療RA的靶點(diǎn)，通過(guò)用uniprot ID獲得靶點(diǎn)全稱及簡(jiǎn)寫，按“uniprot ID”及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)給出的“Probability”數(shù)值排序，得到忠倫-5治療RA的潛在靶點(diǎn)90個(gè)(Tab 1)。

Tab 1 Potential targets of Zhonglun-5 in treatment of rheumatoid arthritis

續(xù)表1

2.2 VENNY圖的制作為獲得5味藥的共同作用靶點(diǎn)，通過(guò)VENNY圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，將各味藥及相應(yīng)的靶點(diǎn)通過(guò)Venn diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作VENNY圖，發(fā)現(xiàn)雌激素受體β(estrogen receptor beta，ESR2)、細(xì)胞色素P450 19A1(cytochrome P450 19A1，CYP19A1)、雄激素受體(Androgen receptor，AR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)靶點(diǎn)為5種單味藥共同作用的靶點(diǎn)，且較多作為共同靶點(diǎn)出現(xiàn)(Fig1)。

Fig 1 Different colors represented different herbs.

2.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析考慮到疾病靶點(diǎn)和其它蛋白的相互作用，為全面闡釋靶點(diǎn)機(jī)制，將上述數(shù)據(jù)集的靶點(diǎn)及已有實(shí)驗(yàn)證明的靶點(diǎn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及白介素6(interleukin-6，IL-6)通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白-蛋白相互作用信息[3]，下載數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理及拓?fù)浞治?，根?jù)自由度設(shè)置節(jié)點(diǎn)顏色及大小，得到網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)。圖中蛋白節(jié)點(diǎn)92個(gè)，邊754個(gè)。節(jié)點(diǎn)顏色由白到黃，顏色越深，節(jié)點(diǎn)自由度越高，節(jié)點(diǎn)大小由自由度決定，節(jié)點(diǎn)自由度越高節(jié)點(diǎn)越大。內(nèi)圈為自由度排序?yàn)榍?0的節(jié)點(diǎn)。

2.4 GO插件分析結(jié)果通過(guò)Cytoscape中的GO插件對(duì)數(shù)據(jù)集中的靶點(diǎn)進(jìn)行參與生物過(guò)程分析及KEGG通路分析。生物過(guò)程分析結(jié)果表明，靶點(diǎn)主要富集于對(duì)活性氧的反應(yīng)(response to reactive oxygen species)、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、糖皮質(zhì)激素生物合成過(guò)程(glucocorticoid biosynthetic process)、凋亡信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)(positive regulation of apoptotic signaling pathway)、等多種生物過(guò)程中(Fig 3)，圖中Y軸為生物過(guò)程名稱，X軸為靶點(diǎn)在生物過(guò)程中的比例，各節(jié)點(diǎn)顏色代表P值，節(jié)點(diǎn)大小代表參與生物過(guò)程的靶點(diǎn)數(shù)；KEGG結(jié)果表明靶點(diǎn)參與的信號(hào)通路包括類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器(ABC transporters)、PPAR信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)等43條通路。將靶點(diǎn)參與通路信息導(dǎo)入到Cytoscape軟件中得到“靶點(diǎn)-通路”圖(Fig 4)，圖中以自由度設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小，橙色通路，藍(lán)色為靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)109個(gè)，邊341個(gè)，節(jié)點(diǎn)平均自由度為5.927。

Fig 2 Target protein interaction network of Zhonglun-5

2.5 Hub節(jié)點(diǎn)選擇及分子對(duì)接驗(yàn)證將上述建立的“靶點(diǎn)-通路”圖導(dǎo)入Cytoscape軟件中，運(yùn)行cytoHubba插件，對(duì)這些節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，選取排名前8的關(guān)鍵靶點(diǎn)(得分大于10)，分別為絲裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，MAPK9)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2。找到與靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分包括番紅花酸(crocetin)、玫瑰樹(shù)堿(ellipticine)、水麥冬甙(triglochinin_qt)、8-異戊烯基-山奈酚(8-首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了90個(gè)蒙藥忠倫-5抗RA的靶點(diǎn)，并通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了這些靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，其中Akt1、IL-6、TNF、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、EGFR及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)等與多種蛋白存在聯(lián)系，這些結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，證明了本次研究的科學(xué)性和可靠性。蛋白-蛋白相互作用結(jié)果證明這些靶點(diǎn)并非單獨(dú)起效，而是通過(guò)相關(guān)的作用關(guān)系、相互聯(lián)系isopentenyl-kaempferol)、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮(wighteone)、刺芒柄花素(formononetin)、苦楝子酮(melianone)、槲皮素(quercetin)和皮樹(shù)脂醇(40957-99-1)，應(yīng)用Systems Dock進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如下(Fig 5)，圖中顏色越深得分越高(最高值為8.416)。

Fig 3 Gene ontology terms for biological process of Zhonglun-5

Fig 4 Target-pathways

3 討論

Fig 5 Results of molecular docking

而產(chǎn)生效應(yīng)。隨后我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)忠倫-5主要參與氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、糖皮質(zhì)激素合成代謝、骨代謝、炎癥及凋亡等生物過(guò)程作為主要途徑作用于RA，反映出忠倫-5是多途徑的作用特點(diǎn)。在KEGG通路分析中，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)參與的ras信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、erbb信號(hào)通路、自噬相關(guān)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路均與RA密切相關(guān)。分析靶點(diǎn)-通路圖，得到蒙藥忠倫-5治療RA的Hub節(jié)點(diǎn)：MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，找到的活性成分包括番紅花酸、玫瑰樹(shù)堿、水麥冬甙、8-異戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮樹(shù)脂醇，最后通過(guò)分子對(duì)接確定了活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)活性成分中番紅花酸不能與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合，但番紅花酸可以與其他RA相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，且有較多研究證實(shí)其具有抗炎作用，因此番紅花酸可作為活性成分存在。靶點(diǎn)中的EGFR與活性成分的結(jié)合能力較低，其它靶點(diǎn)均可與活性成分結(jié)合。

Hub節(jié)點(diǎn)中MAPK8、MAPK9、MAPK14為MAPK家族成員，MAPK作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的多種生物過(guò)程，且已有以MAPK作為治療靶點(diǎn)的成功案例。MAPK14是p38的α亞型，其參與的p38-MAPK通路與RA發(fā)病機(jī)制中的炎癥密切相關(guān)，活化的p38通過(guò)激活下游蛋白，間接影響基因表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[11]，在RA滑膜組織中，炎性因子等因素刺激使T細(xì)胞的p38異?；罨?，抑制腫瘤壞死因子受體超家族成員6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，F(xiàn)as)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使組織中的炎癥持續(xù)存在；p38還能導(dǎo)致炎性因子、趨化因子的基因過(guò)度表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)RA的滑膜細(xì)胞炎癥的發(fā)展。MAPK8和MAPK9是JNK的1/2亞型，JNK通路被認(rèn)為與RA相關(guān)，當(dāng)JNK和JNK上游的蛋白磷酸化被抑制時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)表達(dá)都被降低[12]，而MMP-1和MMP-13是介導(dǎo)軟骨破壞的關(guān)鍵蛋白。Akt1是蛋白激酶B，現(xiàn)有研究中，Akt主要通過(guò)PI3 Kinase-Akt經(jīng)典信號(hào)途徑參與RA的發(fā)病，PI3 K/Akt通路通過(guò)激活各種下游靶蛋白，產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)[13]，且PI3 K/Akt/mTOR通路能夠調(diào)節(jié)自噬，為RA的研究熱點(diǎn)。STAT1和STAT3為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，在RA纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)中均有影響[14]，此外JAK/STAT信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)基因的表達(dá)[15]，參與軟骨的破壞中。有關(guān)忠倫-5與MMPs表達(dá)的研究已有證實(shí)，但對(duì)上游的STAT的影響，還需進(jìn)一步研究。Bcl-2是與凋亡密切相關(guān)的基因，具有抗凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞生命的作用。上述很多靶點(diǎn)及通路都作用于Bcl-2，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2作為訶子和川楝子共同的靶點(diǎn)，參與多種生物過(guò)程及信號(hào)通路，并且可能以抗凋亡的作用干預(yù)疾病的發(fā)展，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

最終我們確定了忠倫-5治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要靶點(diǎn)MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，活性成分有玫瑰樹(shù)堿、水麥冬甙、8-異戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮樹(shù)脂醇，本研究發(fā)現(xiàn)蒙藥忠倫-5主要通過(guò)MAPK通路、P13 K/Akt通路、JAK-STAT通路以及一些炎性因子發(fā)揮治療RA的作用。有關(guān)忠倫-5在RA中的抗炎作用既往已有一些報(bào)道，反映了本研究結(jié)果的可靠性，其它靶點(diǎn)及通路可作為后續(xù)研究的理論基礎(chǔ)。本研究較為全面地闡述了經(jīng)典蒙藥復(fù)方忠倫-5治療RA的靶點(diǎn)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為臨床應(yīng)用該方提供了更多的理論依據(jù)，也為今后深入地研究忠倫-5的藥理作用機(jī)制提供了新的線索。