非洲豬瘟病毒核酸檢測存在的問題與分析

文│李靜 宗克新（山東省曹縣畜牧服務中心） 辛學強（山東省陽谷縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心） 侯敬民 姜利 高玉環(huán) 宇凌（山東省菏澤市動物疫病預防控制中心）

一、引言

自2018年8月我國遼寧省發(fā)生第一起非洲豬瘟疫情以來，我國多省份相繼發(fā)生非洲豬瘟疫情。為了加強非洲豬瘟的防控，各省強制地市配備了非洲豬瘟檢測設備，并緊急培訓檢測人員，建設了PCR檢測室。時間緊檢測任務重，有的檢測室建設不符合要求，有的檢測人員技術不過關、儀器操作不熟練，操作方法不嚴謹?shù)龋荒軠蚀_檢測出病毒核酸，造成了非洲豬瘟檢測比對試驗不能一次通過。

二、非洲豬瘟病毒核酸檢測可能存在的問題

非洲豬瘟病毒核酸檢測可能出現(xiàn)檢測結果假陰性和假陽性。

1.檢測結果出現(xiàn)錯誤的原因分析。筆者根據(jù)自身從事RT-PCR檢測10余年積累的經(jīng)驗，分析檢測結果出現(xiàn)假陰性或假陽性的原因有以下3點：

（1）采樣不規(guī)范。隨機采樣時不注意仔細觀察豬的精神狀態(tài)，也沒有按要求逐頭測量體溫，因采樣任務重，只采集較集中的幾頭，而沒有按要求間隔采集，致使沒有采集到可疑豬只，造成采集的樣本不含有非洲豬瘟病毒。

（2）檢測試劑盒質(zhì)量有問題。我國非洲豬瘟疫暴發(fā)突然，很多廠家一窩蜂似的生產(chǎn)核酸檢測試劑，在短時間內(nèi)迅速獲得批準文號，但質(zhì)量卻參差不齊。很多試劑盒不設計提取陽性對照，只設置反應陽性對照，很難驗證提取過程是否能提出病毒核酸。筆者曾做過非洲豬瘟的比對試驗：省比對實驗提供的2個弱陽性樣品，一個稀釋2倍，另一個不做稀釋，提取的病毒DNA模板分別用4種試劑進行擴增，4個試驗全部出現(xiàn)陽性對照，證明試驗都成立。A試劑結果為2個樣品可疑，B試劑只檢出未稀釋樣品可疑，C試劑檢測結果為2個樣品全陰性，D試劑為進口試劑，檢測結果為2個弱陽性。由此可見，部分非洲豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒存在質(zhì)量問題，極有可能真正的陽性樣品檢出結果為假陰性，不能科學指導非洲豬瘟疫情的防控。

（3）檢測過程存在不符合操作規(guī)程的地方。核酸檢測是微量操作，要求極為嚴格。首先，人員問題。臨時培訓的非洲豬瘟病毒核酸檢測人員，不能正確熟練地使用微量移液槍，不懂得加液時一檔進二檔出，槍頭外黏帶的一個液滴就會超過2微升，這樣配制出來的擴增體系誤差太大，陽性對照跑不出來曲線，造成試驗不成立，陽性樣品更不會擴增出陽性曲線。這樣既浪費了試劑，又延誤了檢測結果上報時間，不利于疫情防控。其次，微量移液槍使用問題?？h級獸醫(yī)實驗室大多存在經(jīng)費緊張的問題，檢測用的耗材不能足量配備，在做試驗時操作不規(guī)范，移液槍與槍頭不相配造成配液加樣誤差大：如果反應液為18微升，RNA模板為2微升，選用20微升的移液槍卻用200微升的槍頭，這樣配制的反應體系肯定不是20微升，從而出現(xiàn)假陰性結果。再次，配制反應體系不嚴謹。試劑標注量不一定精確，每次使用都應精密量取，而不應該認為大差不差就行。有的檢測人員在配制反應體系時，不用移液槍量取試劑，不按照試劑瓶標注的量進行配制，造成擴增反應體系有很大偏差。最后，常溫操作時間過長。任何PCR檢測的反應體系，在常溫下保存時間過長都容易失效。提取儀大多是32份或是36份的，提取96份樣品集中擴增要分3次提取，增加了操作時長；另外，反應體系配制過早，且分裝速度慢，提取的RNA模板和反應體系如果常溫放置時間過長都會造成假陰性出現(xiàn)。

2.檢測結果出現(xiàn)假陽性的原因分析。通過生物安全大檢查發(fā)現(xiàn)，以下原因可能產(chǎn)生假陽性：

（1）實驗室功能分區(qū)設計有問題。由于我國非洲豬瘟疫情影響面積大，很多縣級動物疫病預防控制中心原來沒有分子生物學檢測室，由于受場地和財政資金的限制，臨時快速建設的RT-PCR實驗室，個別實驗室不符合非洲豬瘟病毒核酸檢測要求。按分子生物學檢測要求，PCR檢測實驗室至少分為配液室、核酸提取室、核酸擴增室，每個室都應有獨立的緩沖區(qū)，且配液室與核酸提取室之間應設置傳遞窗，核酸提取室與核酸擴增室不能設置傳遞窗。

個別實驗室只有2個功能檢測室，即配液與提取在一個房間內(nèi)進行，RNA擴增在一個房間進行。往提取試劑盒中加樣品和配制反應體系在同一個生物安全柜內(nèi)進行，很可能給非洲豬瘟病毒核酸擴增體系的配制造成污染，使被檢測樣品成為假陽性。

有的實驗室有3個功能分區(qū)，但是各自沒有設置獨立的緩沖空間，導致PCR實驗室與公共走廊沒有形成有效隔離，這樣也有可能使擴增室的高濃度核酸片段以氣溶膠的形式進入配液室和核酸提取室，造成樣品污染，出現(xiàn)假陽性。另外，這樣還極有可能使病毒外散，不利于疫情防控。

有的實驗室雖然有3個功能分區(qū)，也有獨立的緩沖間，但是樣品提取與加提取后的模板在同一個生物安全柜內(nèi)同時進行，這樣極可能使樣品交叉污染，使檢測結果不準確。

（2）檢測人員的影響。有些實驗室因為檢測人員數(shù)量少，檢測人員未嚴格按照“樣品準備區(qū)→核酸提取區(qū)→核酸擴增區(qū)”的順序定向移動，往往穿著同一套工作服在核酸提取室提取完樣品接著到配液室配液，又到核酸提取室加提取的RNA模板，然后再到核酸擴增室到上機擴增，再接著到核酸提取區(qū)室提取下一波樣品。如此反復，造成人為核酸污染。

非洲豬瘟病毒在我國大面積流行，特別是在經(jīng)濟欠發(fā)達以畜牧業(yè)為主要經(jīng)濟來源的地區(qū)，疫情防控更嚴峻，檢測任務更繁重。大量的非洲豬瘟病毒核酸檢測，但卻沒有專業(yè)的從業(yè)人員，不少地方現(xiàn)抓人員臨時培訓上場，這些人員在短時間內(nèi)操作不規(guī)范也不熟練，不管是樣品核酸提取環(huán)節(jié)，還是擴增體系配制環(huán)節(jié)，如果微量移液槍操作不當，容易使移液槍與不同試劑和樣品之間發(fā)生交叉污染。有的檢測人員在試驗時移液槍頭掉在生物安全柜臺面上不丟棄，而繼續(xù)使用；有的八聯(lián)排管蓋不倒置或是不小心將八聯(lián)排管蓋掉落在地板上再撿起來用；還有的在加樣時忘記更換槍頭。放置樣品或模板時，由于密封不嚴而溢于容器外，造成不同樣品或不同模板間產(chǎn)生交叉污染；有的是加好反應體系及樣品RNA模板后，八聯(lián)排管蓋不能一次按順序?qū)忾]或是封閉不嚴密，模板之間互相污染。這些都會造成檢測結果錯誤，導致檢測結果可能出現(xiàn)假陽性，導致健康的豬群被錯殺，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失。

（3）樣品前處理的影響。因非洲豬瘟病毒存在較強的傳染性，且存活時間較長，因此按照操作規(guī)范，樣品在從樣品保存箱取出時應對保存箱內(nèi)外及樣品外包裝噴灑乙醇進行消毒，然后在水浴中60℃滅活30分鐘。但實際操作中，樣品檢測量極大，為了節(jié)約時間快速出結果，有的實驗人員不對樣品外包裝進行乙醇消毒及滅活。這樣就會污染檢測環(huán)境，極有可能造成樣品間的交叉污染造成假陽性結果出現(xiàn)。

（4）試驗后消毒不徹底。每一波試驗結束后，不對操作臺、移液器、生物安全柜、提取儀等進行有效清潔和消毒，導致這些儀器設備表面殘留樣品污物及核酸片段，給下波試驗造成潛在污染隱患，使檢測結果出現(xiàn)假陽性。

三、改進的措施及建議

1.國家獸藥監(jiān)管部門和中國動物疫病預防控制中心規(guī)定非洲豬瘟病毒核酸試劑必須設置提取陰陽性對照品，并加大對所有試劑產(chǎn)品的抽檢力度。提取陰陽性對照品可以驗證提取過程及配液過程是否有誤，因此必須設置。國家獸藥監(jiān)管部門在對非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒進行抽檢時，應對各個廠家的產(chǎn)品進行比對，驗證各個廠家的試劑盒是否能檢出非洲豬瘟病毒核酸弱陽性樣品，篩選出合格產(chǎn)品，對不合格產(chǎn)品的廠家責令限期整改。

2.實驗室嚴格分區(qū)。病毒核酸檢測實驗室，必須嚴格按P2實驗室的具體要求設計建設，將實驗室嚴格分隔成配液室、核酸提取室、核酸擴增室3個完全獨立的功能室，做到對互不相容活動的相鄰試驗區(qū)域形成真正有效的隔離，設置傳遞窗口，并安裝紫外燈，防止交叉污染的發(fā)生。

3.省級動物疫病預防控制中心對市縣級疫控中心加強指導。

（1）規(guī)范非洲豬瘟病毒采樣工作。采樣人員在采樣前采取措施挑選出體溫升高和精神沉郁的豬只，采集血液，屠宰場在屠宰生豬時每一批都應采集血槽血。

（2）省級動物疫病預防控制中心指導市縣兩級疫病預防控制中心加強對非洲豬瘟病毒核酸檢測人員的培訓。用于非洲豬瘟病毒核酸檢測的主要方法是熒光PCR。與其他檢測方法比較，該方法靈敏性高、特異性強，便于快速檢測。由于縣級以下以及部分屠宰場獸醫(yī)實驗室過去較少使用熒光PCR等分子生物學方法開展大規(guī)模病原學檢測，還須進一步加強培訓和實際操作，使其進一步熟練掌握該檢測方法。培訓要求檢測人員嚴格按操作規(guī)程對樣品外包裝進行消毒，并于60℃水浴鍋或金浴鍋滅活30分鐘。

檢測人員應熟知微量移液槍的注意事項，配液加樣時精確操作，一檔進二檔出，槍頭外不得黏附液滴，取用20微升以下的液體應用20微升以下的移液槍，并應用與之相配的20微升槍頭。為防止常溫放置時間過長造成核酸模板失活，應將已提取的模板蓋封板膜4℃保存。反應體系分裝及加模板時，八聯(lián)排管下應放置冰盒，并在加RNA模板時最好使用1～10微升量程的8道移液槍，盡量減少操作時間。同時，人員不能亂竄，應該通過傳遞窗傳遞樣品，傳遞時注意相通的窗門不能同時打開。每次試驗前后用75%乙醇或配制好的氫氧化鈉消毒液擦拭工作臺面以及可能接觸到核酸的冰箱、門、窗等把手處、儀器設備，再用紫外線照射整個實驗工作區(qū)域，不少于30分鐘。試驗產(chǎn)生的廢棄槍頭、EP管等廢棄物應置氫氧化鈉消毒液中浸泡12小時以上，在試驗結束后將所有廢棄物裝入高壓袋內(nèi)密閉121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，避免污染環(huán)境。