鐘宏文 朱麗康 溫曉靜 朱凱琦 劉讓萬

（贛縣區(qū)人民醫(yī)院 江西贛州 341100）

1 前言

新型冠狀病毒（COVID-19）是一種RNA 病毒，以噴嚏、咳嗽等呼吸道飛沫傳播及接觸傳染為主，會(huì)引起人類呼吸系統(tǒng)感染，發(fā)熱、乏力、干咳，逐漸出現(xiàn)呼吸困難是感染者的一般臨床癥狀， 絕大多數(shù)感染者預(yù)后良好，少數(shù)患者起病癥狀輕微，發(fā)熱不明顯，嚴(yán)重者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、感染性休克、難以糾正的代謝性酸中毒及重度凝血功能障礙等癥狀，甚至導(dǎo)致死亡，且該病毒傳染性極強(qiáng)[1]。 快速、及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷和鑒別診斷技術(shù)對(duì)COVID-19 診治和疫情的防控尤為重要。目前，方法的多樣性和多種方法的互補(bǔ)使用為COVID-19 的檢測(cè)兩大趨勢(shì)。 細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)等為主要檢測(cè)方法[2]，由于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單，低成本，結(jié)果準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，而且檢測(cè)過程封閉，較好地解決了環(huán)境污染問題，已成為臨床COVID-19 檢測(cè)的主流方法[3]。 實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）核酸檢測(cè)技術(shù)已被列入國(guó)家衛(wèi)健委COVID-19 診療規(guī)范，是COVID-19 感染的最重要病原學(xué)確診指標(biāo)及痊愈判斷標(biāo)準(zhǔn)，也是目前臨床首選的技術(shù)。

2019 年 12 月，湖北武漢暴發(fā) COVID-19 疫情，隨后蔓延至全國(guó)，截至2020 年2 月29 日，現(xiàn)有確診病例35 239 例，累計(jì)治愈出院病例41 625 例，累計(jì)死亡病例2 870 例，累計(jì)確診病例79 824 例，其中，贛縣區(qū)現(xiàn)有確診病例7 例治愈出院，累計(jì)死亡1 例，累計(jì)確診病例9 例，已連續(xù)24 天無新增確診病例。 當(dāng)前疫情防控形勢(shì)正積極向好的勢(shì)態(tài)發(fā)展，但疫情依然嚴(yán)峻復(fù)雜，已嚴(yán)重影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們的生產(chǎn)生活，威脅人民群眾的生命健康。為了有效遏制疫情傳播蔓延，阻斷病原體在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)傳播，保證醫(yī)療質(zhì)量與安全，基層醫(yī)院生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室開展COVID-19 檢測(cè)大勢(shì)所趨。

本文參考國(guó)家衛(wèi)健委最新頒發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》（國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕184 號(hào)）、《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）》（國(guó)衛(wèi)辦科教函〔2020〕70 號(hào)）和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的制定的《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》及附件《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第五版）》（國(guó)衛(wèi)辦疾控函〔2020〕156 號(hào)），中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)發(fā)布的《2019 新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)專家共識(shí)》等文件，介紹了贛縣區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科在BSL-2 實(shí)驗(yàn)室開展COVID-19多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)策略及試驗(yàn)人員的生物安全防護(hù)應(yīng)對(duì)措施。

2 開展COVID-19 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)的條件

《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》及附件《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第五版）》將COVID-19 作為急性上呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》甲類管理的乙類傳染病。COVID-19 暫歸屬于第二類生物危害等級(jí)的高致病性病原微生物[4]。 嚴(yán)格按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》和《能夠感染人類的高致病性微生物（毒物）的種類或樣本運(yùn)輸管理?xiàng)l例》（衛(wèi)生部45 號(hào)令）等相關(guān)要求采集、運(yùn)送、檢測(cè)、儲(chǔ)存標(biāo)本。依據(jù)《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指引（第二版）》相關(guān)規(guī)定：在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）開展COVID-19核酸提取，使用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人保護(hù)[5]。生物安全二級(jí)及以上的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室開展COVID-19 核酸檢測(cè)須經(jīng)設(shè)區(qū)的衛(wèi)生主管部門備案，同時(shí)具備以下條件：（1）實(shí)驗(yàn)室必須經(jīng)省級(jí)衛(wèi)生主管部門審核備案。（2）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員必須經(jīng)省臨床檢驗(yàn)中心基因檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)合格 （持有崗位合格證書）。 （3）實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備必須滿足高效過濾效率（HEPA）檢測(cè)合格的A2 及以上專用生物安全柜，生物安全達(dá)到二級(jí)（P2）級(jí)別以上。 （4）試劑應(yīng)選擇使用經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)能檢測(cè)COVID-19 基因組中開放讀碼框1ab（ORF1ab）和核殼蛋白（N）或小包膜蛋白（E），有注冊(cè)證號(hào)廠家生產(chǎn)的檢測(cè)試劑，并在使用前做性能驗(yàn)證。 贛縣區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室選擇濟(jì)南鑫貝西 BIOBASE-BSC-1100ⅡB2-X 生物安全柜 （國(guó)械注準(zhǔn)20163542275），杭州安譽(yù)AGS-4800（國(guó)械注準(zhǔn)20173400921）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀，主要使用中山達(dá)安公司（國(guó)械注準(zhǔn)20203400063）、湖南圣湘公司（國(guó)械注準(zhǔn)20203400064）生產(chǎn)的試劑備用。

3 BSL-2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的三級(jí)個(gè)人防護(hù)

在BSL-2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的所有操作必須符合《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）》的三級(jí)個(gè)人防護(hù)要求，做好個(gè)人防護(hù)用品的穿戴：穿一次性防護(hù)服、工作服外穿隔離衣、防滲漏膠鞋、短雙層一次性鞋套，戴醫(yī)用防護(hù)口罩或N95 口罩、工作帽、護(hù)目鏡（或面屏）及雙層防滲漏乳膠手套，加強(qiáng)手衛(wèi)生。進(jìn)入BSL-2 實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照BSL-2 生物安全防護(hù)用品的穿戴和脫卸流程操作，脫卸一次性防護(hù)用品時(shí)須注意每脫卸一件防護(hù)用品前都先用75%酒精噴灑防護(hù)用品的外表面進(jìn)行消毒。 護(hù)目鏡（或面屏）用有效氯濃度1 000 mg/L 消毒液浸泡30 min，清水清洗晾干后再進(jìn)行重復(fù)使用。

4 臨床檢測(cè)流程

在贛縣區(qū)COVID-19 疫情防控指揮部統(tǒng)一指揮下，經(jīng)贛縣區(qū)人民醫(yī)院COVID-19 防控領(lǐng)導(dǎo)小組協(xié)調(diào)，通知檢驗(yàn)科主任開始準(zhǔn)備承擔(dān)COVID-19 感染者、疑似病例、門診發(fā)熱留觀人員、密切接觸者及集中隔離點(diǎn)醫(yī)學(xué)觀察人員的核酸檢測(cè)的臨床檢驗(yàn)工作。

4.1 準(zhǔn)備工作

科主任接到通知后，立即召開科室緊急啟動(dòng)會(huì)議，傳達(dá)通知精神，分配布置工作任務(wù)。 結(jié)合科室實(shí)際應(yīng)急安排3 名持有PCR 上崗證的檢測(cè)人員（其中有高級(jí)職稱1 名，中級(jí)職稱2 名），邀請(qǐng)?jiān)噭S家技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)，上級(jí)醫(yī)院基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室（PCR實(shí)驗(yàn)室）專家指導(dǎo)及醫(yī)院院感專家督導(dǎo)，同時(shí)做好試劑、耗材儲(chǔ)備、防護(hù)用品的調(diào)備等工作。 明確要求對(duì)疑似或確診患者的樣本要有顯著的特殊生物安全標(biāo)識(shí)，由臨床醫(yī)師或疾控人員負(fù)責(zé)樣本采集，統(tǒng)一專人送檢，專人接收，集中分批檢測(cè)，以減少暴露的機(jī)會(huì)和個(gè)人防護(hù)裝備的消耗。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員按照《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）》的三級(jí)個(gè)人防護(hù)要求做好個(gè)人防護(hù)， 隨時(shí)準(zhǔn)備接收患者樣本進(jìn)行檢測(cè)。

4.2 樣本運(yùn)送及接收

樣本運(yùn)送人員戴醫(yī)用N95 口罩和防護(hù)眼罩，穿工作服外隔離衣、二層鞋套及防滲漏長(zhǎng)靴，戴雙層乳膠手套和工作帽按生物安全二級(jí)個(gè)人防護(hù)流程做好防護(hù)[6]。 收集樣本時(shí)必須仔細(xì)檢查采樣容器是否完好無損并蓋緊， 采樣容器上是否寫明患者姓名、病區(qū)/床號(hào)、樣本的種類及采樣時(shí)間（醫(yī)生或護(hù)士填寫），確認(rèn)樣本合格并在樣本接收登記本上做好登記后，放置于有生物危害標(biāo)識(shí)的具有獨(dú)立的雙層密封包裝袋、保存盒、密閉的“COVID-19 檢測(cè)樣本專用運(yùn)送箱”，用輔助容器固定，以免顛簸導(dǎo)致泄漏或破碎，再對(duì)包裝袋、保存盒、轉(zhuǎn)運(yùn)箱的外表面噴灑75%酒精或有效氯濃度1 000 mg/L 消毒液消毒。 外送樣本需在“COVID-19 檢測(cè)樣本專用運(yùn)送箱”內(nèi)放置醫(yī)用冰袋，溫度保存4℃。 樣本運(yùn)送人員在離開病區(qū)時(shí)，以75%酒精噴灑手套、外層隔離服和鞋套。樣本運(yùn)送人員將“COVID-19 檢測(cè)標(biāo)本專用運(yùn)送箱”置于避光、防雨、防震的樣本運(yùn)送車上，須非常仔細(xì)、小心地送至實(shí)驗(yàn)室。 核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作人員要做好三級(jí)個(gè)人防護(hù)，在BSL-2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)做好接收樣本、核對(duì)信息、編號(hào)排序工作，75%酒精噴灑后取出內(nèi)層樣本管（內(nèi)含病毒保存液）包裝桶，并將其轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，打開內(nèi)包裝，取出樣本管，75%酒精噴灑外表面，放置于56℃恒溫水浴鍋，滅活30 min。

4.3 標(biāo)本檢測(cè)

工作人員嚴(yán)格按照COVID-19 核酸（ORF1ab 基因/N 基因）RT-PCR 檢測(cè)流程操作，在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制裂解工作液及反應(yīng)體系；在樣本處理區(qū)生物安全柜內(nèi)完成滅活樣本的處理、核酸裂解及提取、加樣；到擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，按標(biāo)準(zhǔn)操作程序設(shè)置樣本信息、設(shè)定擴(kuò)增參數(shù)和程序：50℃/15 min→95℃/15 min→94℃/15 s、55℃/45 s，45 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增時(shí)間105 min，分析判斷結(jié)果，審核報(bào)告，記錄COVID-19核酸（ORF1ab 基因 ／N 基因）RT-PCR 檢測(cè)流程表。因開蓋、加樣、離心過程可能會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，試驗(yàn)操作中應(yīng)注意：樣本開蓋前，觀察有無樣本溢出，輕輕旋轉(zhuǎn)打開樣品蓋；當(dāng)用干浴，將子彈頭蓋緊，防止爆蓋；每次離心時(shí)，須等離心機(jī)完全停止后，靜止10 min；每次加樣動(dòng)作要輕柔避免飛濺，忌用加樣槍反復(fù)吹打液面，在操作過程中，動(dòng)作要輕柔，工作人員雙手不能隨意進(jìn)出生物安全柜。

4.4 清除和消毒

試驗(yàn)結(jié)束后，及時(shí)清理生物安全柜內(nèi)的物品，以75%酒精擦拭外表面后移出，重新歸位。用75%的酒精擦拭生物安全柜墻壁和臺(tái)面，并通風(fēng)30 min 后封閉運(yùn)行。同時(shí)檢查操作的區(qū)域壓力是否在正常范圍。用75%酒精噴灑PCR 擴(kuò)增儀外表面，10 min 后再次擦拭。 用含1 000 mg/L 濃度有效氯消毒液擦拭操作臺(tái)面、地面、物體表面，紫外線照射60 min，每天至少2 次。 實(shí)驗(yàn)室工作人員嚴(yán)格按照BSL-2 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)出操作規(guī)程離開實(shí)驗(yàn)室。

4.5 廢棄物處理

剩余或廢棄樣本等污染物裝入高壓滅菌袋中，用高壓指示帶扎口，并用75%酒精噴灑袋外側(cè)后，移出生物安全柜放置PCR 核酸檢測(cè)標(biāo)本廢物專用運(yùn)送箱內(nèi)。工作人員做好二級(jí)生物安全個(gè)人防護(hù)，經(jīng)121℃，15 min 高壓蒸汽滅菌后放入醫(yī)療廢物垃圾桶統(tǒng)一處理，并做好樣本銷毀記錄。

5 安全危險(xiǎn)及其防護(hù)措施

由于COVID-19 具有多種傳播途徑，《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》和《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》中已明確指出“在相對(duì)封閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能”，實(shí)驗(yàn)室高頻率檢測(cè)感染病人咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等樣本的核酸，因此生物安全防護(hù)尤其是氣溶膠感染途徑的防控尤為重要。 由于樣品的處理過程中，生物危害性可能出現(xiàn)：移動(dòng)樣本管可產(chǎn)生振蕩，開蓋時(shí)氣溶膠噴出；當(dāng)樣本過量或傾斜，可能發(fā)生外溢；離心后或干浴管爆蓋都有可能產(chǎn)生氣溶膠。 因此，所有COVID-19 核酸檢測(cè)樣本處理前必須用56℃，30 min 滅活或75%乙醇預(yù)處理[7]，嚴(yán)格按照要求進(jìn)行防護(hù)，遵循《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）》的要求，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)接收、處理標(biāo)本，采用醫(yī)用防護(hù)口罩或N95 口罩，工作服外穿隔離衣，戴雙層乳膠手套、醫(yī)用防護(hù)帽、護(hù)目鏡（或面屏），加手衛(wèi)生進(jìn)入BSL-2 實(shí)驗(yàn)室。

5.1 防止氣溶膠產(chǎn)生和吸入的個(gè)人防護(hù)措施

在生物安全柜臺(tái)面鋪上紙巾；待離心機(jī)完全停止后，靜止10 min，樣本蓋在生物安全柜中輕輕旋轉(zhuǎn)打開；試驗(yàn)人員試驗(yàn)時(shí)佩戴醫(yī)用防護(hù)口罩或N95 口罩、雙層乳膠手套和護(hù)目鏡（或面屏）。

5.2 防止標(biāo)本溢出的個(gè)人防護(hù)措施

當(dāng)生物安全柜內(nèi)樣本灑溢時(shí)，用含5 500 g/L 有效氯消毒30 min 以上；當(dāng)可能出現(xiàn)較嚴(yán)重的實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室空間密閉，禁止無關(guān)人員出入，以避免污染物發(fā)生擴(kuò)散，用含有5 500 g/L 的有效氯消毒液的吸水紙巾對(duì)污染區(qū)進(jìn)行覆蓋消毒30 min以上[8]，嚴(yán)格按照處理活病毒生物安全操作的要求清理污染物，并用高壓蒸汽滅菌處理，實(shí)驗(yàn)室開窗通風(fēng)，防止次生危害。 處理后操作人員立即更換外層手套。

5.3 離心、干浴樣本管爆蓋時(shí)的個(gè)人防護(hù)措施

若離心機(jī)正在運(yùn)轉(zhuǎn)，先關(guān)閉電源，保持離心機(jī)密閉30 min，讓氣溶膠沉積；若離心機(jī)已停止，保持蓋子密閉30 min；實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)戴雙層橡膠手套，用鑷子取出爆蓋樣本管，放入盛有含5 500 g/L 有效氯消毒劑容器中浸泡30 min；用75%酒精擦拭2 次離心機(jī)、干浴器內(nèi)腔及外蓋，用水清洗后干燥，移動(dòng)紫外線燈照射60 min。 所有清理材料按感染性廢物處理[9]。

6 結(jié)語

綜上所述，在基層醫(yī)院的BSL-2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展COVID-19 核酸檢測(cè)可以在第一時(shí)間為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù)，有助于疾病治療和預(yù)后判斷；為疫情防控提供技術(shù)支持，有助于遏制疫情擴(kuò)散蔓延勢(shì)頭。由于臨床實(shí)驗(yàn)室人員檢測(cè)臨床樣本含高致病性活病毒微生物，需要在56℃條件下滅活30 min 或使用75%乙醇預(yù)處理所有COVID-19 核酸檢測(cè)樣本，并在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行樣本處理。 實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)加強(qiáng)COVID-19 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南及生物安全指南學(xué)習(xí)，增強(qiáng)生物安全意識(shí)，科學(xué)、理性、規(guī)范做好個(gè)人防護(hù)，熟練掌握檢測(cè)技術(shù)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，確保實(shí)驗(yàn)室工作人員零感染。