孫洪光 孝飛飛 賈中明 王希龍 張國(guó)強(qiáng) 楊振林

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害著廣大女性的健康［1］。化療是乳腺癌治療常用的治療方式之一,但其療效卻一直受到多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的限制。乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells,BCSCs)被認(rèn)為是在腫瘤細(xì)胞中極少部分具有干細(xì)胞的特性的細(xì)胞亞群,雖只占極少部分,但卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的根源。既往研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)化療治療后,乳腺癌細(xì)胞中BCSCs 的比例較化療前有了明顯的提高［2］,而跨膜蛋白引起的化療藥物外排是提高細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受的重要途徑。為此,本實(shí)驗(yàn)擬采用MACS 分選獲得CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群,測(cè)定其對(duì)化療藥物的外排作用,并檢測(cè)其藥物外排相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,探究其與多藥耐藥的關(guān)系,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 多藥耐藥MCF-7/ADR 細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室低劑量緩慢誘導(dǎo)法所得,RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司,胎牛血清購(gòu)自Hyclone 公司,阿霉素購(gòu)自Invitrogen 公司,MTT 購(gòu)自Sigma 公司,鼠抗人P-gp-PE、鼠抗人CD24-FITC、兔抗人CD44-PE 均購(gòu)自eBioscience 公司。主要儀器：流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becman Coulter 公司)、激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、MACS 分選系統(tǒng)(德國(guó)Miltenyi 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7/ADR 細(xì)胞株于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng),保持37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。為維持細(xì)胞株的耐藥性,培養(yǎng)基中阿霉素濃度保持為1 mg/ml。試驗(yàn)開(kāi)始前2 周,改用無(wú)藥物完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 MACS 分選CD44+CD24-/low亞群 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),1000 r/min 離心10 min,棄上清,重懸,每1×107細(xì)胞加入10 μl 的CD24-Biotin,混勻,低溫孵育15 min,重懸,加入20 μl的Anti-biotin MicroBeads,混勻,低溫孵育15 min,于500 μl 的緩沖液中重懸,應(yīng)用MACS 分選系統(tǒng)陰性分選CD24-/low細(xì)胞。按同樣步驟陽(yáng)性分選上步分選所得CD24-/low細(xì)胞,獲取CD44+CD24-/low亞群。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選前后CD44+CD24-/low細(xì)胞比例 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,磷酸緩沖液(PBS)洗滌,以2×107/ml 細(xì)胞濃度重懸,取50 μl 單細(xì)胞懸液,加入含5 μl 鼠抗人CD24-FITC 和0.625 μl 兔抗人CD44-PE的流式緩沖液50 μl,4℃孵育30 min,緩沖液洗滌2 次,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp 表達(dá)水平,激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm,應(yīng)用EXPO32 ADC Analysis 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)化療藥物敏感程度 取MCF-7/ADR細(xì)胞及CD44+CD24-/low亞群,調(diào)整濃度為1×104/ml,每孔100 μl 接種于96 孔板,37℃,5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜,實(shí)驗(yàn)組加入梯度濃度阿霉素,對(duì)照組未加阿霉素處理,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μl 濃度5 mg/ml 的MTT 溶液,培養(yǎng)4 h,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,震蕩10 min,在560 nm 處讀取OD 值。按公式計(jì)算：抑制率(%)=(對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD 值)/對(duì)照組OD 值×100%,SPSS20.0 計(jì)算IC50。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡下觀察胞內(nèi)阿霉素蓄積取MCF-7/ADR 細(xì)胞及分選所得CD44+CD24-/low亞群,調(diào)整濃度,種板,37℃,5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。PBS 沖洗玻片3 次,加入2 mg/ml 阿霉素,37℃,5%CO2培養(yǎng)1 h,PBS 沖洗,4%多聚甲醛溶液固定15 min,甘油封片。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察胞內(nèi)熒光強(qiáng)度,留取圖片。各參數(shù)保持統(tǒng)一,選細(xì)胞數(shù)量相近的視野拍照,應(yīng)用Image-pro Plus 6.0軟件定量分析胞內(nèi)化療藥物蓄積水平。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp 表達(dá)水平 取狀態(tài)良好的細(xì)胞,PBS 洗滌2 次,重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml,于95 μl 懸液中加入5 μl 鼠抗人P-gp-PE,4℃避光孵育30 min,緩沖液洗滌2 次,上機(jī)檢測(cè)P-gp表達(dá)水平,激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm,應(yīng)用EXPO32 ADC Analysis 進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 觀察指標(biāo) 分析MACS 分選CD44+CD24-/low亞群結(jié)果,分選前后CD44+CD24-/low細(xì)胞比例,CD44+CD24-/low亞群對(duì)化療藥物的敏感性,CD44+CD24-/low亞群胞內(nèi)化療藥物蓄積,CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的P-gp表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MACS 分選CD44+CD24-/low亞群結(jié)果分析 MACS分選前后分別計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,被分選出來(lái)的CD44+CD24-/low細(xì)胞比例約為6%。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選前后CD44+CD24-/low細(xì)胞比例結(jié)果分析 MCF-7/ADR 細(xì)胞中CD44+CD24-/low細(xì)胞比例為6.21%,與分選所得CD44+CD24-/low細(xì)胞比例相符。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),分選所得 CD44+CD24-/low亞群中CD44+CD24-/low細(xì)胞比例約為93.85%,達(dá)到進(jìn)一步相關(guān)試驗(yàn)要求。

2.3 CD44+CD24-/low亞群對(duì)化療藥物的敏感性CD44+CD24-/low亞 群 的IC50 為(17.37±0.46)mg/ml,MCF-7/ADR 細(xì)胞的IC50 為(15.84±0.66)mg/ml,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 CD44+CD24-/low亞群胞內(nèi)化療藥物蓄積 激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),MCF-7/ADR 細(xì)胞及分選所得CD44+CD24-/low亞群均具有較強(qiáng)的藥物外排作用,阿霉素多集中于細(xì)胞核膜表面內(nèi)側(cè),在細(xì)胞核中心阿霉素蓄積較少。MCF-7/ADR 細(xì)胞較CD44+CD24-/low亞群胞內(nèi)蓄積更高濃度阿霉素,熒光強(qiáng)度分別為(571.67±11.15) 和(518.67±11.93),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群的P-gp 表達(dá)水平CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群P-gp 表達(dá)熒光強(qiáng)度為(114906.70±2560.19),MCF-7/ADR 細(xì)胞P-gp 表達(dá)熒光強(qiáng)度為(101177.10±2171.86),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為具有自我更新、無(wú)限增殖以及多向分化能力,是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的根源。2003 年,Al-Hajj 等［3］發(fā) 現(xiàn)CD44+CD24-/low亞群具有干細(xì)胞特性。目前普遍將CD44+CD24-/low作為最為常用的BCSCs 分選標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MACS 分選獲得CD44+CD24-/low亞群,進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其比例,結(jié)果示＞90%,符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。

化療是乳腺癌治療的重要手段,但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥是制約化療療效的重要因素,嚴(yán)重影響了治療效果。多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜。P-gp 可依賴ATP 供能將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外,從而使腫瘤細(xì)胞躲避化療藥物的殺傷［4］。有研究發(fā)現(xiàn),沉默P-gp 表達(dá)可大大提高阿霉素的治療效果［5］。編碼P-gp 表達(dá)的多藥耐藥1 基因表達(dá)水平與乳腺癌耐藥性存在重要關(guān)系［6］,抑制多藥耐藥1 表達(dá)可使MCF-7細(xì)胞系對(duì)藥物敏感性提高。

本研究證實(shí),與MCF-7/ADR 細(xì)胞相比,阿霉素對(duì)CD44+CD24-/low亞群的殺傷能力更弱,IC50 高于MCF-7/ADR 細(xì)胞。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像檢測(cè),MCF-7/ADR 細(xì)胞及CD44+CD24-/low亞群均具有較強(qiáng)的阿霉素外排能力。進(jìn)一步分析表明,CD44+CD24-/low亞群內(nèi)蓄積的阿霉素明顯少于MCF-7/ADR 細(xì)胞,說(shuō)明藥物外排作用可能是BCSCs 擁有更強(qiáng)化療藥物抵抗能力的直接原因。本研究顯示,與一般腫瘤細(xì)胞比較,CD44+CD24-/low亞群細(xì)胞膜的P-gp 表達(dá)水平更高,P-gp作為跨膜蛋白家族的重要成員,在化療治療過(guò)程中,該亞群可以把更多的化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外,從而影響化療治療的效果,也是乳腺癌治療過(guò)程中的一個(gè)難題。由此可見(jiàn),CD44+CD24-/low亞群對(duì)于化療藥物具有較強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力,能把化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外,從而躲避化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷,可能是造成BCSCs 化療抵抗的主要原因。

綜上所述,CD44+CD24-/low亞群具有更強(qiáng)的藥物外排能力,可將更多的化療藥物排到胞外,不易被化療藥物殺傷,從而影響治療效果。如何有效減少BCSCs 對(duì)化療藥物的外排作用,增加化療藥物對(duì)其殺傷作用,成為今后乳腺癌治療研究的重要研究方向。