孝飛飛 孫洪光 李建廠 朱淑霞 田春梅

多藥耐藥是化療失敗的最主要原因之一。凋亡抑制蛋白和多藥耐藥膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp 過度表達(dá)是多藥耐藥的兩個(gè)主要原因［1］,Apollon 是凋亡抑制蛋白家族主要成員,尤其在復(fù)發(fā)白血病、誘導(dǎo)無緩解、髓外白血病患者中高表達(dá)［2］。本實(shí)驗(yàn)通過siRNA 技術(shù)沉默562/DNR 細(xì)胞中Apollon 基因表達(dá),觀察P-gp 表達(dá)水平,檢測(cè)K562/DNR 對(duì)化療藥物敏感性的變化?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染靶向Apollon 的siRNA K562/DNR)、細(xì)胞對(duì)照組(K562/DNR)和陰性對(duì)照組(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的siRNAnc)。K562/DNR 細(xì)胞株由濱州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購于美國Invitrogen 公司；兔抗人Apollon 多克隆抗體一抗購于美國Santa Cruz 公司,帶有紅色熒光標(biāo)記的四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)二抗購于上海江萊生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽購于美國Sigma 公司；Apollon 及β-actin 引物由上海賽百盛公司合成；靶向Apollon 的siRNA 序列、陰性對(duì)照siRNA 序列由上海吉瑪公司合成。

1.2 RT-PCR 法 檢測(cè)ApollonmRNA的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組采用前期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于6孔板,每組2孔,于24h后提取總RNA,兩步法行RT-PCR。Apollon引物序列：Sense 5'-TGGCTCAAGCTGGATTTTAT-3',Anti-sense 5'-TTCAGACCAAGGTTCATCAG-3',擴(kuò)增長度116bp。內(nèi)參照β-actin 序 列：Sense 5'-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3',Anti-sense 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACG-3',擴(kuò)增片段513 bp。PCR 產(chǎn)物經(jīng)含EB 的10 g/L 瓊脂糖凝膠上電泳,采集、分析圖像,計(jì)算出目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平：以Apollon/β-actin 灰度比值(ODR)表示。

1.3 Western Blot 檢測(cè)P-gp 的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染5 d 后細(xì)胞,依次加入bufferA、B、C,裂解細(xì)胞,離心后收集上清,取等量蛋白,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,5%脫脂奶粉的TBST 封閉液封閉2 h,經(jīng)1×TBST 充分漂洗(10 min×3 次),加兔抗人MDR-1 多克隆抗體(稀釋度為1∶300),4℃孵育12 h,充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋度為1∶2400),室溫孵育1 h,充分漂洗,化學(xué)發(fā)光法顯色。用α-tublin 做內(nèi)參重復(fù)以上步驟。以P-gp/α-tubulin 比值表示目的基因蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 MTT 法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VCR、DNR 耐藥細(xì)胞株K562/DNR 對(duì)化療藥物敏感性的變化 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔板。實(shí)驗(yàn)分組同前,即分別為K562/DNR/shApollon、K562/DNR/shNC 和K562/DNR。每 組細(xì)胞加入不同濃度的VCR 及DNR,VCR 終質(zhì)量濃度為0、0.01、0.1、1.0、10 和100 μg/ml,DNR 終質(zhì)量濃度為0、0.15、0.3、0.6、1.2 和2.4 μg/ml,于加藥48 h 后加入5 g/L 的MTT 20 μl,檢測(cè)各孔490 nm 波長處吸光度(A)值,計(jì)算各組細(xì)胞對(duì)VCR、DNR 的細(xì)胞增殖抑制率(IR),IR=(1-實(shí)驗(yàn)組p 值/細(xì)胞對(duì)照組A 值)×100%,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 觀察指標(biāo) 比較三組細(xì)胞Apollon mRNA 表達(dá)情況、P-gp 糖蛋白表達(dá)情況；分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后對(duì)VCR、DNR 的敏感性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；多組間比較采用Oneway ANOVA 分析；多個(gè)均數(shù)間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞Apollon mRNA 表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組Apollon mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為(24.233±0.108)%,低于細(xì)胞對(duì)照組的(90.031±0.182)%和陰性對(duì)照組的(83.686±0.076)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組Apollon mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 P-gp 糖蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組P-gp 糖蛋白表達(dá)水平為(78.360±0.517)%,高于細(xì)胞對(duì)照組的(37.120±0.309)%及陰性對(duì)照組的(36.316±0.193),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染前后對(duì)VCR、DNR 的敏感性 實(shí)驗(yàn)組K562/DNR 的VCR、DNR 的IC50 值明顯低于細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組的IC50 值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組未加藥、DNR、VCR 的K562/DNR 的凋亡率均顯著高于細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；K562/DNR 對(duì)化療藥VCR 和DNR 敏感性明顯增強(qiáng)。見表1。

表1 各組IC50、凋亡率比較(±s)

表1 各組IC50、凋亡率比較(±s)

注：與實(shí)驗(yàn)組比較,aP＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

Apollon 基因高表達(dá)腫瘤往往惡性程度高、浸潤深,早期即有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 晚期,該基因陽性者提示預(yù)后差［3］。近年來急淋白血病化療5 年生存率可以達(dá)到80%以上,但髓系白血病對(duì)化療的反應(yīng)不敏感,治療效果差,90%以上的患者死于不同程度的MDR［4］。有研究稱Apollon 基因在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上是一個(gè)關(guān)鍵的基因調(diào)控點(diǎn)［5］,本文通過RNAi 沉默K562/DNR細(xì)胞中Apollon 基因表達(dá),觀察P-gp 表達(dá)水平,檢測(cè)K562/DNR 對(duì)化療藥物敏感性的變化,進(jìn)而探討Apollon能否成為逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞MDR 的有效靶點(diǎn)。

P-gp 可將化療藥物泵出細(xì)胞外,使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低,造成細(xì)胞MDR,對(duì)化療不敏感或療效差的腫瘤細(xì)胞均高表達(dá)P-gp。本實(shí)驗(yàn)還運(yùn)用MTT 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組K562/DNR 細(xì)胞對(duì)DNR、VCR 的IC50 明顯降低,表明Apollon 基因被抑制后,K562/DNR 對(duì)化療藥物敏感性明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步證實(shí)靶向沉默抑制凋亡基因Apollon 能降低耐藥P-gp 糖蛋白表達(dá),提高了耐藥細(xì)胞株內(nèi)化療藥物濃度,實(shí)驗(yàn)中加用化療藥物的實(shí)驗(yàn)組耐藥細(xì)胞株出現(xiàn)大量死亡,逆轉(zhuǎn)了K562/DNR 細(xì)胞的耐藥。

綜上所述,Apollon 基因高表達(dá)與白血病細(xì)胞MDR密切相關(guān),抑制Apollon 基因表達(dá)后能顯著降低耐藥P-gp 蛋白表達(dá)水平,增強(qiáng)了化療藥物對(duì)K562/DNR 細(xì)胞增殖的抑制作用,可將Apollon 作為逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥的靶基因,為難治及復(fù)發(fā)性白血病的治療提供新思路。