白立勇，葛新霞，王建華

（山東省醫(yī)藥工業(yè)設計院，山東濟南 250000）

1 微生物發(fā)酵概述

1.1 概念

微生物發(fā)酵就是給微生物提供適宜生存的環(huán)境，通過微生物來對材料的性質(zhì)進行改變，并最終獲得目標產(chǎn)物的過程。在這一過程中，影響產(chǎn)物的主要因素包括原料、菌種和環(huán)境，不同的原料和不同的菌種，在不同的環(huán)境下會產(chǎn)生不同的東西，當然，在發(fā)酵過程中，由于生產(chǎn)環(huán)境的變化，很可能不會產(chǎn)生目標產(chǎn)物，甚至產(chǎn)生一些有毒有害的產(chǎn)物，這就需要對發(fā)酵環(huán)境進行精確控制。在現(xiàn)代制藥工程中，很多發(fā)酵過程生產(chǎn)單額藥品，都是初級代謝產(chǎn)物或副產(chǎn)物，這對發(fā)酵控制就有更嚴格的要求，工藝難度也更大。

1.2 應用

目前，該技術(shù)在很多領(lǐng)域都有所應用，比如說食品行業(yè)，最常見的就是釀酒和酸奶，日常生活中蒸饅頭的過程，實質(zhì)上也是一種微生物發(fā)酵的過程。在化工領(lǐng)域，更多的是生產(chǎn)農(nóng)藥，比如生物農(nóng)藥和殺蟲劑等。在醫(yī)藥領(lǐng)域，該技術(shù)的出現(xiàn)可以說救了無數(shù)人的生命，在二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)的時候，青霉素通過該技術(shù)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，現(xiàn)如今的抗生素、氨基酸等很多藥物，也是通過該技術(shù)工藝實現(xiàn)的。但由于該生產(chǎn)的過程是微生物自發(fā)進行的，所以在制藥領(lǐng)域如何更精準地控制微生物，把握發(fā)酵的進程，并回收需要的產(chǎn)物，成為技術(shù)發(fā)展的核心與關(guān)鍵。

2 細胞培養(yǎng)微載體的類型

2.1 經(jīng)典型細胞培養(yǎng)微載體

首先是電荷型光面微載體，該載體研發(fā)的時間為1967年，使用DEAE-Sepha-dexA50凝膠，用DEAE-Sepha-dexA50凝膠當做培養(yǎng)細胞的載體物質(zhì)，該凝膠已經(jīng)經(jīng)過N，N-二乙基乙醇氨的處理，所以其表面十分光滑，在處理之后其自身所攜帶的正電荷數(shù)值約為3.5meq/g，利用電荷相互吸引的特質(zhì)，使得細胞都可以較好地吸附并黏貼在微載體物質(zhì)的表面上。電荷型光面微載體已經(jīng)成為了當前GE 公司較為經(jīng)典的一類細胞微載體產(chǎn)品。我國相關(guān)學者開展了Cytodex1微載體的一系列研究工作，針對該微載體的利用率以及最高細胞密度數(shù)值等進行了探究。經(jīng)過實驗證明，若微載體的濃度提升，那么其最大細胞的密度就會呈現(xiàn)出下降的趨勢，在3g/L 時的用量，其狀態(tài)最佳，不管是細胞貼壁的面積還是微載體的利用率數(shù)值都比較高。Cytodex1 微載體并不會存在動物源的組成成分，所以其微載體的生物性能比較好，安全性也比較強。和其相關(guān)的細胞生長技術(shù)的操作性也比較強，可以大致滿足相應的動物細胞規(guī)模培養(yǎng)標準要求。其次是膠原包被型微載體，Cytodex1細胞實際的適用范圍相對來說會比較廣泛，但是其并不適用于一些表面黏附以及功能性低下的細胞，若將該微載體應用到其類型的細胞內(nèi)，那么其細胞的附著率極為低下，且各類細胞的生長速度也比較慢，細胞凋亡的現(xiàn)象比較明顯，細胞很容易產(chǎn)生脫落等的問題。想要構(gòu)建出一種生物相容性比較強的細胞附著表面，就需要借助豬皮Ⅰ型膠原蛋白，采取共價連接的形式，讓其交聯(lián)在Sephadex 微球表面上，開發(fā)Cytodex3及同類包被膠原覆層等的微載體類型，對Cytodex3進行細胞支架的研究，分析上皮細胞以及上皮性疾病的題外細胞培養(yǎng)模型。

2.2 酶解型細胞微載體

首先是明膠或膠原微載體，在培養(yǎng)經(jīng)典型細胞微載體時，其總體細胞分離的工序十分復雜，且消化過程的把控難度也較高。微載體主要是將明膠和疏水性礦物油整合在一起，使用攪拌混合的形式，同時進行NaBH4的還原處理，讓其生成淡黃色的明膠微載體。該類型的微載體是一種非剛性球的物質(zhì)，且其生物的相容性也較強，可以完全性溶解明膠物質(zhì)，細胞的分離以及收獲十分的簡便。在進行多類細胞培養(yǎng)分析工作，可以使得細胞載體更好的分離。其次是生物降解型微載體，當前，人們開始借助聚乳酸、殼聚糖等物質(zhì)進行干細胞的培養(yǎng)工作，在細胞支架注入到機體之后，可以直接被降解以及吸收，極大程度地給我國制藥的應用提供了便利。

3 細胞培養(yǎng)微載體在制藥的應用

3.1 蛋白質(zhì)藥物與疫苗研究

首先是蛋白質(zhì)藥物的研究，微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)種類豐富，且相關(guān)的工藝模式也十分的靈活，要科學合理地選擇使用灌注、流加等各項工藝技術(shù)，同時還需要盡可能地滿足藥物生產(chǎn)的各類實際性需求，使得蛋白藥物的研發(fā)工作可以進展得更為順暢，其在我國生產(chǎn)領(lǐng)域中的應用范圍也開始逐漸的變廣。細胞微載體培養(yǎng)技術(shù)主要被應用到蛋白藥物的生產(chǎn)以及研發(fā)工作中，相關(guān)的藥物種類也比較繁雜，各項工藝技術(shù)也較為成熟。微載體培養(yǎng)工藝技術(shù)的使用會在提升單抗產(chǎn)量的過程中，讓其糖基化水平趨于穩(wěn)定，保障了單抗的品質(zhì)。其次是病毒培養(yǎng)與疫苗研究，細胞微載體培養(yǎng)技術(shù)在我國病毒培養(yǎng)以及疫苗領(lǐng)域研究的發(fā)展速度相對來說較快，一些公司會使用微載體培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Vero 細胞生產(chǎn)禽流感疫苗，其生產(chǎn)的規(guī)模已經(jīng)擴大到6 000L。

3.2 干細胞培養(yǎng)及組織工程

首先是干細胞的培養(yǎng)，干細胞的分離以及大規(guī)模化培養(yǎng)始終是制藥事業(yè)發(fā)展的核心，采取體外分離技術(shù)所獲得的干細胞數(shù)量相對來說較少，存在一定的約束限制，根本無法滿足當前我國臨床的實際性需求。以往的干細胞單層培養(yǎng)工作中，其傳代次數(shù)逐漸的提升，培養(yǎng)的時間也逐漸延長，這就使得干細胞逐漸的喪失了一定的自我更新能力，同時還讓其朝向多向分化潛能等的特征發(fā)展。細胞微載體培養(yǎng)技術(shù)的應用不但可以讓細胞基質(zhì)維持相應的均一性，同時還可以使得細胞在較短的時間范圍內(nèi)進行高密度的生長，讓干細胞進行體外大規(guī)模的培養(yǎng)。其次是組織工程，在組織工程學當中，微載體主要應用到種子細胞大規(guī)模性的擴增項目中，讓其作為細胞轉(zhuǎn)運以及傳遞的重要支架，可以不斷地放大組織過程，同時滿足當前我國制藥日益增長的臨床需求。

4 微生物發(fā)酵制藥種類

4.1 菌體發(fā)酵

菌體發(fā)酵是最傳統(tǒng)的一種發(fā)酵方式，這種發(fā)酵所得到的藥物，在古代就已經(jīng)被應用，比2細胞培養(yǎng)微載體在生物醫(yī)學的應用

如說冬蟲夏草、茯苓等，都是菌體發(fā)酵得到的產(chǎn)物。菌體發(fā)酵最大的特點就是過程控制比較容易，一般來說產(chǎn)物的生產(chǎn)速度，與發(fā)酵速率是成正比的，即產(chǎn)物獲得最大的時期，就是發(fā)酵速度最快的時候，因此在生產(chǎn)中關(guān)鍵就在于控制好發(fā)酵環(huán)境，如果能夠保證環(huán)境的相對恒定，那產(chǎn)物合成率就會更高，經(jīng)濟效益也會更好。

4.2 酶發(fā)酵

青霉素就是酶發(fā)酵的產(chǎn)物，在現(xiàn)代的制藥體系中，酶發(fā)酵已經(jīng)成為重要的技術(shù)，不僅生產(chǎn)出很多救人性命的抗生素，還發(fā)明出很多重要的藥品。比如說抗癌的天冬酰胺酶、治療血栓的納豆激酶等。因為酶發(fā)酵的產(chǎn)物很多都具有特殊的藥用功能，因此該技術(shù)制藥的研發(fā)已經(jīng)成為生物制藥發(fā)展的主流方向之一。在該技術(shù)中，發(fā)酵過程是利用誘導或抑制劑，從而生產(chǎn)出特定發(fā)酵產(chǎn)物實現(xiàn)的，這意味著需要在發(fā)酵過程中進行更多的控制和干預。為了提高產(chǎn)量，對于菌種的選育、培養(yǎng)基的配制和發(fā)酵條件的控制方面，就更為嚴格。

4.3 代謝產(chǎn)物發(fā)酵

代謝產(chǎn)物就是伴隨著菌種生長產(chǎn)生的產(chǎn)物，這種產(chǎn)物在發(fā)酵過程中一般來說生產(chǎn)比較少，但通過人工的干預，產(chǎn)量也能夠有顯著的提高。生活中經(jīng)常見到的氨基酸、核苷酸、維生素等藥品，正是代謝發(fā)酵得到的。由于代謝發(fā)酵需要的產(chǎn)物是與發(fā)酵產(chǎn)物摻雜在一起的，所以工藝的難點就在于收集和分離，當然為了提高產(chǎn)量，通過有效的手段也能提高代謝產(chǎn)物的得率。

4.4 轉(zhuǎn)化發(fā)酵

生物發(fā)酵是一種利用微生物將原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的過程，轉(zhuǎn)化發(fā)酵正是精準的實現(xiàn)這一過程的一種方法。通過加入多種酶，能夠?qū)崿F(xiàn)對化合物的目的性加工，從而得到我們想要的具有藥用價值的化學結(jié)構(gòu)。用于降低身體排異反應的可的松，正是采用該方法生產(chǎn)的。當然除了該藥品，很多獨特作用的激素類藥品都是采用該技術(shù)，該技術(shù)相比于傳統(tǒng)的技術(shù)，是生物發(fā)酵更深化的發(fā)展，是現(xiàn)代科技和制藥技術(shù)的結(jié)晶。

5 應用與實踐

5.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基就好比是微生物的溫床，是給微生物成長繁殖用的，培養(yǎng)基中需要根據(jù)菌種的培養(yǎng)需求提供配制的營養(yǎng)物質(zhì)。為了保證能夠生成目標產(chǎn)物，培養(yǎng)基還必須滿足無菌的要求，一般來說培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基等。不同種類的培養(yǎng)基，適用的培養(yǎng)環(huán)境不同，適用的菌種也不同，因此在制藥生產(chǎn)中，一定要根據(jù)需求選擇。

5.2 菌種制備

菌種，決定了培養(yǎng)過后能夠得到什么，菌種的優(yōu)劣，也影響了產(chǎn)物的產(chǎn)率。因此在制藥工程中，菌種的制備和選擇，同樣是重點工作。一般來說，菌種需要在實驗室條件下進行選育、發(fā)酵實驗成功后，才能被應用于生產(chǎn)。由于菌種在發(fā)展中也會產(chǎn)生品質(zhì)的變化，這微小的變化是更微觀的體現(xiàn)，是看不見摸不到的，所以對于一條工藝上常用的菌種，為了保證其代代活性不變，還需要進行定期的純化和再次育種。

5.3 種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)是一種由少變多的過程，通常來說，是先在實驗室或小型設備上進行小規(guī)模的培養(yǎng)，待培養(yǎng)成熟后，活性達標后，將種子移植到大型發(fā)酵罐中，給予所需的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)，在一定周期后實現(xiàn)種群的擴大，最終獲得需要的產(chǎn)物。在種子培養(yǎng)和擴大過程中，最容易發(fā)生的就是污染，一旦任何流程中被污染，那必然會造成損失，如果不能及時發(fā)現(xiàn)，甚至會導致這一次生產(chǎn)完全性的失敗，因此對無菌操作環(huán)境的要求極高。除此之外，還需要控制好環(huán)境，只有合適的環(huán)境，菌群才能擴散生長，因此就要做好培養(yǎng)環(huán)境的打造，確保發(fā)酵罐能夠得到穩(wěn)定的溫度控制。

5.4 發(fā)酵

種子擴散后，需要經(jīng)過發(fā)酵才能得到所需要的藥品，發(fā)酵過程實質(zhì)上就是種子繁殖生長的過程，在這一過程中關(guān)鍵要素就是要保證環(huán)境無菌和恒定。因此，任何一批發(fā)酵生產(chǎn)過程都是獨立的，即在生產(chǎn)前和生產(chǎn)后，需要進行徹底的蒸汽滅菌，以確保發(fā)酵環(huán)境的無菌。如果發(fā)酵過程需要進行控制，需要添加其他物質(zhì)，也要求全部進行無菌操作。最好能夠?qū)崿F(xiàn)自動化操作，避免人工操作帶來的不利影響。

5.5 處理

該流程就是將需要的產(chǎn)物與廢棄物進行分離的過程，該過程根據(jù)藥品性質(zhì)的不同，工藝上有難有易，容易的僅僅需要簡單的步驟就能得到，難的則需要細致的分離工作。發(fā)酵產(chǎn)物得到后，進入制劑車間制成不同的劑型，對于其他廢氣產(chǎn)物，則進行無污染處理后，進行回收或者丟棄。

6 結(jié)語

綜上所述，隨著我國生物制藥技術(shù)的發(fā)展，越來越多的優(yōu)秀藥品被生產(chǎn)出來，為人們的健康做出了貢獻。在應用這些藥品的時，不要忘記生物發(fā)酵技術(shù)工藝，正因為技術(shù)的進步，才能得到那么多優(yōu)秀的藥品，隨著智能環(huán)境控制和自動化生產(chǎn)的普及，該技術(shù)將會獲得更大的發(fā)展空間。