趙衛(wèi)松，郭慶港，李社增，王亞嬌，鹿秀云，王培培，蘇振賀，張曉云，馬平

西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花黃萎病防治效果及其對(duì)不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落的影響

趙衛(wèi)松，郭慶港，李社增，王亞嬌，鹿秀云，王培培，蘇振賀，張曉云，馬平

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北保定 071000）

【目的】研究土壤中添加西蘭花殘?bào)w（broccoli residues，BR）對(duì)棉花黃萎病及不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為棉花黃萎病的綠色生態(tài)防控和化學(xué)農(nóng)藥的減量施用提供新途徑和思路?！痉椒ā客ㄟ^(guò)田間小區(qū)試驗(yàn)，分別以西蘭花殘?bào)w還田和不含有西蘭花殘?bào)w（CK）的耕層土壤中播種的棉花為試驗(yàn)對(duì)象，監(jiān)測(cè)不同處理的棉花黃萎病的發(fā)生動(dòng)態(tài)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）和高通量測(cè)序（Illumina MiSeq）技術(shù)分別測(cè)定不同時(shí)期土壤中大麗輪枝菌（）DNA拷貝數(shù)量和土壤細(xì)菌群落，進(jìn)而分析西蘭花殘?bào)w還田對(duì)土壤中病原菌數(shù)量變化和土壤細(xì)菌群落的影響。采用主成分分析探索西蘭花殘?bào)w還田對(duì)不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落在門(mén)和屬水平的結(jié)構(gòu)變化特征與規(guī)律?！窘Y(jié)果】西蘭花殘?bào)w還田后棉花黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，且發(fā)病高峰時(shí)間推遲，在發(fā)病高峰期對(duì)黃萎病的防治效果達(dá)到70.77%，建立了整個(gè)生育期內(nèi)病情指數(shù)-時(shí)間病程發(fā)展曲線，平均防治效果為57.21%。與空白對(duì)照相比，西蘭花殘?bào)w還田處理在棉花生長(zhǎng)季和非生長(zhǎng)季的4個(gè)階段土壤中大麗輪枝菌DNA拷貝數(shù)量分別降低了10.96%、11.11%、25.95%和11.25%。高通量測(cè)序分析表明，不同生育時(shí)期西蘭花殘?bào)w還田處理顯著提高了土壤細(xì)菌多樣性，豐富度指數(shù)Chao1均顯著上升，ACE指數(shù)在播種前期、花鈴期和吐絮期顯著上升。與空白對(duì)照相比，在不同生育時(shí)期內(nèi)，西蘭花殘?bào)w還田后土壤中的放線菌門(mén)（Actinobacteria）菌群的相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著上升。同時(shí)研究表明，西蘭花殘?bào)w還田后優(yōu)勢(shì)菌群組成在不同生育時(shí)期存在差別，在播種前期和苗期，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）菌群上升為優(yōu)勢(shì)菌群；在蕾期和花鈴期，藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）菌群成為優(yōu)勢(shì)菌群。主成分分析表明，西蘭花殘?bào)w還田改變了苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析表明，西蘭花殘?bào)w還田顯著增加了鏈霉菌屬（）和芽孢桿菌屬（）菌群的相對(duì)豐度?！窘Y(jié)論】西蘭花殘?bào)w還田能夠有效抑制棉花黃萎病的發(fā)生，降低土壤中大麗輪枝菌DNA拷貝的數(shù)量，改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，增加有益微生物的相對(duì)豐度，是一種有效控制棉花黃萎病的綠色措施。

西蘭花殘?bào)w；大麗輪枝菌；棉花黃萎??；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序；生育時(shí)期

0 引言

【研究意義】棉花黃萎?。╟otton verticillium wilt）是由大麗輪枝菌（）侵染引起的真菌性維管束病害，是導(dǎo)致棉花減產(chǎn)和纖維品質(zhì)下降的主要病害[1-2]，已成為限制我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。目前，有關(guān)棉花黃萎病防治的研究主要集中在抗性品種、輪作及微生物菌劑和化學(xué)藥劑應(yīng)用等方面[1,3-5]。由于大麗輪枝菌具有致病力分化嚴(yán)重、變異速度快、傳播途徑多和在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)[2,6]，導(dǎo)致抗病品種出現(xiàn)抗性喪失的現(xiàn)象[7-8]；過(guò)去防治土傳病害主要依靠化學(xué)藥劑進(jìn)行熏蒸處理，不僅降低了棉花的品質(zhì)，還破壞了土壤的生態(tài)系統(tǒng)，影響環(huán)境。因此，亟需尋找環(huán)境友好型的黃萎病防控技術(shù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用植物及其殘?bào)w是有效防治作物土傳病害的途徑之一[9-10]。西蘭花（var.）殘?bào)w（broccoli residues，BR）還田能夠有效降低花椰菜[11-12]、茄子[13-14]、馬鈴薯[15-16]、草莓[17]等黃萎病的發(fā)生，Shetty等[11]研究表明，西蘭花及其他部分十字花科作物體內(nèi)含有硫代葡萄糖甙，其在芥子酶水解作用下降解為異硫氰酸酯，從而可控制土傳病害的發(fā)生；許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花殘?bào)w還田后降低了茄子、花椰菜和馬鈴薯黃萎病的發(fā)生，其防病機(jī)理主要是通過(guò)向環(huán)境中釋放具有抑菌功能的次生代謝物質(zhì)，改變土壤微生物多樣性，降低土壤病原菌或微菌核數(shù)量、增加土壤中有益微生物菌群豐度[12-16]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序深度深和獲得數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn)，能更真實(shí)地揭示微生物群落的復(fù)雜性和多樣性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花黃萎病的防控研究尚少，筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，土壤中添加一定比例的西蘭花殘?bào)w對(duì)棉花黃萎病具有較好的防治效果[18]，但關(guān)于西蘭花殘?bào)w對(duì)棉花黃萎病及其不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以西蘭花殘?bào)w還田深翻后對(duì)棉花黃萎病的防治效果為研究主線，以棉花不同生育時(shí)期的土壤為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，分析西蘭花殘?bào)w還田后棉花不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌多樣性和群落組成的變化，揭示土壤微生物對(duì)西蘭花殘?bào)w處理的響應(yīng)機(jī)制，闡釋棉花黃萎病與土壤微生物間的互作關(guān)系，為深入研究西蘭花殘?bào)w防治棉花黃萎病的生態(tài)機(jī)制提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，為棉花黃萎病的綠色防控和化學(xué)農(nóng)藥的減量施用提供新途徑和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以西蘭花品種‘炎秀’、棉花品種‘邯686’（耐黃萎病品種）為供試材料，由河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，用于田間試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)區(qū)域概況、試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

河北省邯鄲市成安縣位于冀南平原，東經(jīng)114°29'—114°53'，北緯36°18'—36°30'，是全國(guó)棉花生產(chǎn)百?gòu)?qiáng)縣、優(yōu)質(zhì)棉基地縣。20世紀(jì)90年代初，該地區(qū)棉花黃萎病重病田發(fā)病率達(dá)89.9%，之后利用抗病品種、農(nóng)業(yè)措施（如輪作）等手段，在一定程度上達(dá)到了防治黃萎病的目的，但該病原菌主要由土壤和種子傳播，寄主范圍廣，流行性強(qiáng)，近年來(lái)常有發(fā)生的報(bào)道。

2017年3—11月在成安縣道東堡鄉(xiāng)大堤西村進(jìn)行西蘭花殘?bào)w還田防治棉花黃萎病的試驗(yàn)（N：36o28′17″，E：114o45′55″）。選取地勢(shì)平坦、肥力相對(duì)均勻、連續(xù)多年種植棉花的地塊作試驗(yàn)田。2017年3月上旬，將西蘭花幼苗（三葉一心）移栽到田間，行距70 cm，株距35 cm，種植密度約為2 720株/666.7 m2；2017年5月中旬收獲西蘭花，之后將剩余的植株地上部分和地下部分經(jīng)粉碎機(jī)粉碎、旋耕機(jī)深翻25—30 cm作為處理區(qū)（T，施入西蘭花殘?bào)w約為3 500—3 800 kg/666.7 m2），未種植西蘭花的地塊作為空白對(duì)照區(qū)（CK）。2017年6月1日分別在處理區(qū)和對(duì)照區(qū)播種棉花，每個(gè)處理3次重復(fù)，每小區(qū)面積為45 m2（行長(zhǎng)60 m，每行寬0.75 m），行距75 cm，株距35 cm。在棉花生長(zhǎng)期間，按照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)技術(shù)進(jìn)行水肥、植株蟲(chóng)草害管理。分別在播種前期、苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期，按照“W”形采用多點(diǎn)取樣法，用取土器在棉花行間距離棉花根部10 cm采集0—20 cm耕作層的土壤，每小區(qū)采集約500 g土壤混勻裝于自封袋中，于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)土壤細(xì)菌群落分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 黃萎病發(fā)生調(diào)查 在黃萎病發(fā)生時(shí)期，按照李社增等[19]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)于8月10日、8月21日、8月31日、9月12日和9月21日分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，分別記作DIT1、DIT2、DIT3、DIT4和DIT5。病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)如下，0級(jí)：棉株健康，無(wú)病葉，生長(zhǎng)正常；1級(jí)：棉株1/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；2級(jí)：棉株1/4以上，1/2以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；3級(jí)：棉株1/2以上，3/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；4級(jí)：棉株3/4以上葉片發(fā)病，或葉片全部脫落，棉株枯死。

為明確西蘭花殘?bào)w還田在整個(gè)棉花生育期內(nèi)對(duì)黃萎病的防治效果，建立病情指數(shù)-時(shí)間的病程發(fā)展曲線圖并計(jì)算病程發(fā)展曲線下面積（area under disease progress curve，AUDPC），進(jìn)一步計(jì)算平均防治效果。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；病情指數(shù)（DI）=∑（相應(yīng)病級(jí)×各級(jí)病株數(shù)）/（最高病級(jí)×總株數(shù)）×100；AUDPC=1/2×[（DIT1+DIT2）/（T2-T1+1）+（DIT2+DIT3）/（T3-T2+1）][18]；平均防治效果（%）=（對(duì)照的AUDPC-處理的AUDPC）/對(duì)照的AUDPC×100。

1.3.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的高通量測(cè)序 采用FastDNATMSPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）試劑盒提取土壤基因組DNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）檢測(cè)DNA的純度和濃度。DNA于-20℃保存。

PCR擴(kuò)增：以上述基因組DNA為模板，土壤細(xì)菌16S rDNA的V3-4區(qū)擴(kuò)增采用引物為338F（5′-ACT CCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）[20]，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并添加樣本特異性Barcode序列，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。

文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序：由上海派森諾生物科技有限公司完成。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit在Agilent Bioanalyzer上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，并采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格后，使用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3.3 土壤中大麗輪枝菌數(shù)量的測(cè)定 DNA的提取、重組質(zhì)粒的制備和鑒定：采用CTAB法提取大麗輪枝菌的基因組DNA。利用大麗輪枝菌特異性引物DB19（CGGTGACATAATACTGAGAG）/DB20（GACGATGCGGATTGAACGAA）擴(kuò)增ITS部分序列。將PCR產(chǎn)物與pMD19-T Vector（寶生物工程（大連）有限公司）16℃連接4 h后，轉(zhuǎn)化于DH5感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選白色菌落轉(zhuǎn)接于含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。提取重組質(zhì)粒，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度，計(jì)算單位體積質(zhì)粒所含的DNA拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限進(jìn)行插入片段的序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入片段序列與大麗輪枝菌ITS序列同源性為100%。

質(zhì)粒拷貝數(shù)=

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：將提取的質(zhì)粒10倍梯度稀釋?zhuān)瑢⑵渥鳛槟０暹M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Master Mix（德國(guó)DBI Bioscience公司）10 μL，大麗輪枝菌ITS上下游引物[21]（F：CCCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG；R：CGGGACTCCGATGCGAGCTGTAAC）各1 μL，DNA 1 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

土壤中大麗輪枝菌數(shù)量的測(cè)定：在棉花的不同生育時(shí)期，按照1.2方法采集耕作層土壤，提取DNA，并將其作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，得到不同時(shí)間樣本的循環(huán)閾值，根據(jù)上述建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算土壤中大麗輪枝菌的拷貝數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，Origin 8.6進(jìn)行作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和鄧肯新復(fù)極差法（DMRT）多重比較統(tǒng)計(jì)分析。采用Canoco 4.5軟件對(duì)樣本微生物群落進(jìn)行主成分分析（PCA），并利用CanoDraw軟件進(jìn)行作圖；利用軟件Mothur計(jì)算Alpha多樣性指標(biāo)，包括豐富度指數(shù)（ACE和Chao1）和均勻度指數(shù)（Shannon和Simpson）。

2 結(jié)果

2.1 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響

由圖1可知，西蘭花殘?bào)w（BR）處理與空白對(duì)照（CK）相比，前者降低了黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)。在8月底9月初，黃萎病的發(fā)生達(dá)到高峰，其中西蘭花殘?bào)w還田后發(fā)病率和病情指數(shù)分別為6.75%和1.80，而空白對(duì)照的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為24.62%和6.76?？瞻讓?duì)照7月30日開(kāi)始發(fā)病并表現(xiàn)癥狀，而西蘭花殘?bào)w還田后開(kāi)始發(fā)病時(shí)間和發(fā)病高峰推遲。

圖1 棉花黃萎病發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化

2.2 全生育期內(nèi)對(duì)棉花黃萎病的防治效果

西蘭花殘?bào)w還田后對(duì)棉花黃萎病的田間防治試驗(yàn)結(jié)果表明，在調(diào)查時(shí)間范圍內(nèi)（7月10日至9月21日）不同處理的棉花黃萎病病情指數(shù)呈上升趨勢(shì)。從8月10日開(kāi)始發(fā)病，在發(fā)病高峰期（8月31日）西蘭花殘?bào)w處理對(duì)黃萎病的防治效果達(dá)到70.77%，為了客觀評(píng)價(jià)西蘭花殘?bào)w在整個(gè)生育期內(nèi)對(duì)棉花黃萎病的防治效果，建立了病情指數(shù)-時(shí)間病程發(fā)展曲線，平均防治效果為57.21%（圖2）。

圖2 棉花黃萎病病情指數(shù)-時(shí)間的AUDPC

2.3 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)土壤中病原菌數(shù)量的影響

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立了定量檢測(cè)大麗輪枝菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為=-3.4309+46.756，相關(guān)系數(shù)2=0.9993，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好、擴(kuò)增效率高。西蘭花殘?bào)w處理后在棉花生長(zhǎng)季和非生長(zhǎng)季的不同時(shí)間土壤中病原菌數(shù)量的變化結(jié)果表明，在發(fā)病初期（7月11日），西蘭花殘?bào)w處理土壤樣品中的大麗輪枝菌與空白對(duì)照差異不顯著，在其他3個(gè)時(shí)間（8月21日、10月19日和11月28日），西蘭花殘?bào)w處理顯著降低了土壤中大麗輪枝菌DNA拷貝數(shù)，與空白對(duì)照相比，土壤中病原菌的數(shù)量分別下降了11.11%、25.95%和11.25%（圖3）。

圖3 棉花土壤中大麗輪枝菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定

2.4 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)細(xì)菌群落多樣性的影響

由表1可知，獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，西蘭花殘?bào)w處理后在棉花不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)均顯著上升，ACE指數(shù)在播種前期、花鈴期和吐絮期顯著上升，而Shannon和Simpson指數(shù)差異不顯著。

2.5 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)不同生育時(shí)期樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析，由圖4可知，所有樣品在主成分坐標(biāo)中位于不同的象限，說(shuō)明不同生育時(shí)期樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。通過(guò)對(duì)不同生育時(shí)期的樣品進(jìn)一步分析，對(duì)于空白對(duì)照樣品，分別位于4個(gè)象限，播種前期和苗期位于相同象限，蕾期、花鈴期和吐絮期分別位于不同象限，說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。對(duì)于西蘭花殘?bào)w處理樣品，分別位于4個(gè)象限，其中播種前期和花鈴期位于相同象限，苗期、蕾期和吐絮期分別位于不同象限。

門(mén)水平下西蘭花殘?bào)w還田在不同生育時(shí)期對(duì)土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果表明，在播種前期（T0），空白對(duì)照處理（CKT0）獲得30個(gè)菌群，其中有8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群。西蘭花殘?bào)w處理（BRT0）獲得25個(gè)菌群，其中有9個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度占總體的95%以上。變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、芽單孢菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）為兩個(gè)處理共同的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度分別為30.31%和28.53%、21.96%和26.59%、12.99%和13.87%、13.54%和9.07%、7.36%和7.48%、3.96%和3.57%、2.90%和3.14%、2.77%和3.31%，其中西蘭花殘?bào)w處理后放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)增幅分別為21.08%、6.77%、1.63%、8.28%和19.49%。此外，西蘭花殘?bào)w處理后厚壁菌門(mén)（Firmicutes）菌群上升為優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度由0.55%升至2.17%（圖5）。

表1 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花不同生育時(shí)期細(xì)菌測(cè)序量和群落多樣性的影響

數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

<

Different lowercases after the data indicate significant differences(＜0.05). The same as below

紅色橢圓代表空白對(duì)照（1—15），綠色橢圓代表西蘭花殘?bào)w處理（16—30）The red ellipse represents the blank control (1-15), the green ellipse represents the broccoli residues treatment (16-30)。1—3、16—18：播種前期Pre-sowing stage；4—6、19—21：苗期Seedling stage；7—9、22—24：蕾期Bud stage；10—12、25—27：花鈴期Flowering and boll stage；13—15、28—30：吐絮期Boll-opening stage。Proteobacteria：變形菌門(mén)；Actinobacteria：放線菌門(mén)；Acidobacteria：酸桿菌門(mén)；Gemmatimonadetes：芽單孢菌門(mén)；Chloroflexi：綠彎菌門(mén)；Planctomycetes：浮霉菌門(mén)；Nitrospirae：硝化螺旋菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Cyanobacteria：藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)；Others：其他

在苗期（T1），空白對(duì)照處理（CKT1）和西蘭花殘?bào)w處理（BRT1）分別獲得27個(gè)菌群，分別得到9個(gè)和8個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度占總體的97.09%和96.81%。變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)為共同的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度分別為31.66%和28.59%、20.07%和20.77%、13.20%和16.22%、12.77%和12.84%、7.11%和8.07%、3.02%和3.81%、3.49%和3.54%、4.76%和2.97%，其中西蘭花殘?bào)w處理后放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)和擬桿菌門(mén)均呈現(xiàn)不同程度的上升，其增幅分別為3.49%、22.88%、0.55%、13.50%、26.16%和1.43%。此外，西蘭花殘?bào)w處理后厚壁菌門(mén)菌群上升為優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度由0.51%升至0.79%，Saccharibacteria門(mén)菌群由1.01%降至0.34%（圖5）。

在蕾期（T2），空白對(duì)照處理（CKT2）和西蘭花殘?bào)w處理（BRT2）分別獲得25個(gè)和26個(gè)菌群，分別得到9個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度占總體的96.01%和97.70%。變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)和藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）為共同的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度分別為24.13%和21.88%、21.12%和25.76%、15.79%和14.45%、11.87%和9.03%、11.80%和9.00%、3.49%和2.60%、2.68%和2.21%、3.78%和2.73%、1.36%和9.81%，其中西蘭花殘?bào)w處理后放線菌門(mén)和藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)增幅分別為21.97%和621.32%（圖5）。

在花鈴期（T3），空白對(duì)照處理（CKT3）和西蘭花殘?bào)w處理（BRT3）分別獲得28個(gè)菌群，分別得到9個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度占總體的96.53%和97.27%。變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)為兩個(gè)處理共同的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度分別為26.44%和26.21%、25.76%和27.81%、12.62%和14.01%、12.97%和10.25%、9.63%和9.47%、2.24%和2.15%、2.76%和2.70%、3.08%和3.41%，其中西蘭花殘?bào)w處理后放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)增幅分別為7.96%、11.01%和10.71%。此外，空白對(duì)照中的Saccharibacteria門(mén)成為優(yōu)勢(shì)菌群，而西蘭花殘?bào)w處理后藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)菌群成為優(yōu)勢(shì)菌群（圖5）。

圖5 西蘭花殘?bào)w在棉花不同生育時(shí)期對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在吐絮期（T4），空白對(duì)照處理（CKT4）和西蘭花殘?bào)w處理（BRT4）分別獲得26個(gè)菌群，分別得到8個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度分別占總體的97.22%和97.75%。變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)為共同的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度分別為32.23%和19.55%、20.18%和28.74%、15.31%和12.76%、9.62%和14.13%、10.51%和13.85%、4.11%和3.47%、1.83%和2.12%、3.42%和3.13%，其中西蘭花殘?bào)w處理后放線菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和擬桿菌門(mén)增幅分別為42.42%、46.88%、31.78%和15.85%（圖5）。

細(xì)菌屬水平研究結(jié)果表明（表2），在播種前期（T0），西蘭花殘?bào)w處理后（BRT0）土壤細(xì)菌組成占優(yōu)勢(shì)的前5類(lèi)菌群為、鞘脂單胞菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、和硝化螺菌屬（），相對(duì)豐度分別為2.58%、1.57%、1.29%、1.16%和1.03%，與空白對(duì)照相比，鞘脂單胞菌屬和菌群相對(duì)豐度降幅分別為27.98%和9.38%，而、芽孢桿菌屬和硝化螺菌屬菌群相對(duì)豐度分別為對(duì)照的9.92、3.91和1.27倍。

在苗期（T1），西蘭花殘?bào)w處理后（BRT1）土壤細(xì)菌組成占優(yōu)勢(shì)的前5類(lèi)菌群為鞘脂單胞菌屬、硝化螺菌屬、氣微菌屬（）和芽單胞菌屬（），與空白對(duì)照相比，鞘脂單胞菌屬和硝化螺菌屬菌群相對(duì)豐度差異不顯著，而氣微菌屬和芽單胞菌屬菌群相對(duì)豐度顯著下降，降幅分別為26.85%、30.95%和18.52%。

在蕾期（T2），西蘭花殘?bào)w處理后（BRT2）土壤細(xì)菌組成占優(yōu)勢(shì)的前5類(lèi)菌群為鞘脂單胞菌屬、游動(dòng)放線菌屬（）、鏈霉菌屬（）、和氣微菌屬，與空白對(duì)照相比，上述前5類(lèi)菌群的相對(duì)豐度顯著上升，其增幅分別為8.92%、159.70%、204.16%、76.47%和22.39%。

在花鈴期（T3），西蘭花殘?bào)w處理后（BRT3）土壤細(xì)菌組成占優(yōu)勢(shì)的前5類(lèi)菌群為鞘脂單胞菌屬、類(lèi)諾卡氏屬（）、和芽單胞菌屬，與空白對(duì)照相比，類(lèi)諾卡氏屬和菌群的相對(duì)豐度顯著上升，其增幅分別為22.62%和23.17%，鞘脂單胞菌屬、和芽單胞菌屬的相對(duì)豐度顯著下降，降幅分別為7.18%、11.57%和55.51%。

在吐絮期（T4），西蘭花殘?bào)w處理后（BRT4）土壤細(xì)菌組成占優(yōu)勢(shì)的前5類(lèi)菌群為、鞘脂單胞菌屬、芽單胞菌屬、和玫瑰彎菌屬（），與空白對(duì)照相比，芽單胞菌屬和玫瑰彎菌屬菌群相對(duì)豐度顯著上升，其增幅分別為163.49%、96.49%和42.62%，鞘脂單胞菌屬和菌群相對(duì)豐度顯著下降，降幅分別為6.45%和41.22%。

3 討論

3.1 作物殘?bào)w還田對(duì)植物病害的影響

目前國(guó)內(nèi)外很多研究表明，作物殘?bào)w或秸稈還田對(duì)病害具有積極的防治效果[12-13,22-24]。Subbarao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花殘?bào)w還田后能夠抑制花椰菜黃萎病的發(fā)生，降低了土壤中大麗輪枝菌微菌核的數(shù)量；Inderbitzin等[13-14]研究表明，西蘭花殘?bào)w還田后降低了茄子黃萎病的發(fā)生和病原菌數(shù)量；Davis等[15]研究表明，甜玉米秸稈還田后能夠降低馬鈴薯黃萎病的發(fā)生，防治效果達(dá)到60%—70%，進(jìn)一步研究表明秸稈還田后土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量沒(méi)有直接受到影響，但減少了地上部和根部病原菌的定殖。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，芥菜混入土壤中對(duì)茄子黃萎病的發(fā)生具有良好的防治效果[22]；玉米秸稈還田能夠降低番茄枯萎病的發(fā)生[23]；小麥秸稈還田能夠降低赤霉病菌（）的存活率，減少病害的發(fā)生[24]。然而某些植物殘?bào)w或秸稈還田能夠增加病害的發(fā)生[25-26]，如花生秸稈還田對(duì)棉花種子萌發(fā)具有抑制作用，且秸稈用量與棉花黃萎病的發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系，其能夠?yàn)椴≡姆敝程峁﹫?chǎng)所，導(dǎo)致土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量的增加[25]；水稻秸稈還田后能夠增加稻瘟病、鞘腐病和紋枯病的發(fā)生[26]。然而有關(guān)西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花黃萎病的影響鮮有報(bào)道。

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳病害，防治較為困難。本研究以‘邯686’為供試棉花品種，系統(tǒng)研究了西蘭花殘?bào)w還田對(duì)黃萎病的影響，結(jié)果表明西蘭花殘?bào)w還田降低了黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，且能夠使發(fā)病高峰期推遲，在高峰期對(duì)黃萎病的防治效果為70.77%，在全生育期平均防效為57.21%。同時(shí)，比較了西蘭花殘?bào)w處理對(duì)大麗輪枝菌數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)西蘭花殘?bào)w還田降低了大麗輪枝菌數(shù)量，土壤中病原菌的數(shù)量與其發(fā)病程度相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Subbarao等[12-13,22]的觀點(diǎn)。由此推測(cè)其防治黃萎病的原因之一是能夠降低病原菌的數(shù)量。

表2 屬水平棉花不同生育時(shí)期細(xì)菌菌群相對(duì)豐度（10組中至少1組相對(duì)豐度＞1%）

3.2 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性、組成和結(jié)構(gòu)的影響

微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和可持續(xù)的重要保障，是影響土壤微生態(tài)環(huán)境中生理活性最重要的因子，也是衡量土壤微生態(tài)環(huán)境質(zhì)量和土壤生產(chǎn)力的重要指標(biāo)[27-30]。許多學(xué)者研究表明，作物秸稈還田、有機(jī)肥料或綠肥等處理措施不僅對(duì)作物生長(zhǎng)具有促生作用，而且能夠改變根際微生物數(shù)量、促使活性增強(qiáng)，對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境起到修復(fù)作用[31-33]。

Inderbitzin等[13]研究表明，西蘭花殘?bào)w還田后土壤微生物區(qū)系由“真菌型”向“細(xì)菌型”占主導(dǎo)趨勢(shì)的方向轉(zhuǎn)化；劉建國(guó)等[34]研究發(fā)現(xiàn)，棉花秸稈還田后不僅降低了土壤有害真菌的數(shù)量，而且增加了可培養(yǎng)微生物的數(shù)量，提高了土壤微生物的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)，土壤微生物區(qū)系向著細(xì)菌占主導(dǎo)的趨勢(shì)發(fā)展。本研究結(jié)果表明，土壤中添加西蘭花殘?bào)w后在棉花不同生育時(shí)期與空白對(duì)照相比，土壤細(xì)菌多樣性增加，其中Chao1指數(shù)均顯著上升，ACE指數(shù)在播種前期、花鈴期和吐絮期顯著上升，Shannon和Simpson指數(shù)差異不顯著。在細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)方面，在不同生育時(shí)期，西蘭花殘?bào)w處理和空白對(duì)照中土壤細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)的門(mén)水平菌群相似，其優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單孢菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)。主成分分析表明，不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在不同程度的差異，除了在播種前期外，在苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期西蘭花殘?bào)w處理與空白對(duì)照相比門(mén)水平菌群的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。由表2可知，屬水平細(xì)菌隨著生育時(shí)期變化，其優(yōu)勢(shì)種群發(fā)生改變。如西蘭花殘?bào)w還田后土壤中鞘脂單胞菌屬菌群的相對(duì)豐度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。此外，在相同生育時(shí)期，西蘭花殘?bào)w還田后土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生改變，其相對(duì)豐度呈現(xiàn)出上升或下降的趨勢(shì)，如在吐絮期，和芽單胞菌屬菌群相對(duì)豐度顯著上升，其他菌群如鞘脂單胞菌屬和相對(duì)豐度顯著下降。

通過(guò)西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花黃萎病防治效果的研究，結(jié)合其對(duì)不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落的影響，得出西蘭花殘?bào)w還田后能夠通過(guò)改變土壤細(xì)菌菌群的相對(duì)豐度，且不同生育時(shí)期主要優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度存在差別。

3.3 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)土壤細(xì)菌有益種類(lèi)的影響

鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、溶桿菌屬菌群大多屬于有益微生物，是重要的拮抗微生物種類(lèi)，對(duì)植物病害的生物防治方面具有重要的作用[35-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同生育時(shí)期，西蘭花殘?bào)w還田后與空白對(duì)照相比，鏈霉菌屬菌群的相對(duì)豐度呈顯著上升趨勢(shì)，在播種前期、苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期增幅分別為186.21%、52.17%、141.67%、41.03%和103.70%；對(duì)于芽孢桿菌屬菌群而言，除了在吐絮期西蘭花殘?bào)w還田和空白對(duì)照之間差異不顯著外，在其他時(shí)期菌群的相對(duì)豐度均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，在播種前期、苗期、蕾期和花鈴期增幅分別為290.91%、169.57%、32.50%、110.34%。此外，溶桿菌屬菌群的相對(duì)豐度在蕾期、花鈴期和吐絮期呈顯著上升趨勢(shì)。由此推測(cè)，西蘭花殘?bào)w還田后在一定程度上增加了有益微生物的相對(duì)豐度，進(jìn)而對(duì)黃萎病起到防治作用。

已有研究表明，不同種植年限土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性具有明顯差異，并且土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤養(yǎng)分、pH、溫度、水分和通氣等環(huán)境條件的影響，因此能夠通過(guò)改變土壤理化性質(zhì)的管理措施，在一定程度上改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[38-39]，此外，微生物群落結(jié)構(gòu)還與土壤類(lèi)型、作物品種及類(lèi)型等因素存在相關(guān)性[40-41]。本研究由于時(shí)間的局限性，僅從作物不同生育時(shí)期方面對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，西蘭花殘?bào)w處理與空白對(duì)照相比，在苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期門(mén)水平菌群的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

此外，土壤微生物不僅是土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動(dòng)力，本身也是土壤養(yǎng)分的儲(chǔ)存庫(kù)，對(duì)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與供應(yīng)起著重要作用，是土壤肥力水平的有效指標(biāo)[39]。研究表明，植物秸稈或殘?bào)w還田能夠改變土壤養(yǎng)分，與秸稈或殘?bào)w類(lèi)型、還田量、還田時(shí)間以及還田土壤類(lèi)型有關(guān)[42]。開(kāi)展西蘭花殘?bào)w還田對(duì)土壤理化性質(zhì)的變化及其相關(guān)性研究，可為進(jìn)一步衡量和評(píng)價(jià)西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉田土壤肥力和土壤質(zhì)量的影響提供依據(jù)。

4 結(jié)論

西蘭花殘?bào)w還田是一種操作簡(jiǎn)便且節(jié)約成本的棉花黃萎病防治方法，既有效解決了西蘭花殘?bào)w資源浪費(fèi)的問(wèn)題，又杜絕了西蘭花殘?bào)w隨意處置所造成的環(huán)境問(wèn)題。通過(guò)利用西蘭花殘?bào)w還田，可改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，降低土壤中病原菌數(shù)量，增加有益微生物的相對(duì)豐度，從而達(dá)到對(duì)黃萎病菌的抑制作用，是一種有效的控制棉花黃萎病的措施。

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Control Efficacy of Broccoli Residues on Cotton Verticillium Wilt and Its Effect on Soil Bacterial Community at Different Growth Stages

ZHAO Weisong, GUO Qinggang, LI Shezeng, WANG Yajiao, LU Xiuyun, WANG Peipei, SU Zhenhe, ZHANG Xiaoyun, MA Ping

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Centre of Hebei Province/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to research the effects of broccoli residues (BR) on cotton verticillium wilt and soil bacterial community structure at different growth stages, and to provide new ways and ideas for green ecological control of cotton verticillium wilt and reduction of chemical pesticides.【Method】In the field plot experiment, the soil planted with cotton was treated with broccoli residues and no broccoli residues (CK). the incidence dynamics of cotton verticillium wilt in different treatments were monitored at different growth stages. The number of DNA copies ofwas determined by real-time quantitative PCR, and the structure of soil bacterial communities was measured by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq). The effects of broccoli residues returning to soil on the quantity of pathogen and the community of soil bacteria were analyzed. Principal component analysis (PCA) was used to explore the characteristics and rules of structural changes of soil bacterial community at the level of phylum and genus in different growth stages.【Result】The incidence and disease index of cotton verticillium wilt showed a downward trend after the return of broccoli residues to soil, respectively. Moreover, the peak period of verticillium wilt was delayed, and 70.77% control efficacy was achieved at the peak period. the development curve of disease index and time course of disease in the whole growth period was established, and the average control efficacy was 57.21%. Compared to the blank control, the number of DNA copies ofwas decreased by 10.96%, 11.11%, 25.95% and 11.25% at the 4 stages of cotton growing and non-growing season, respectively, after the return of broccoli residues to soil. Illumina MiSeq analysis showed that broccoli residues treatment significantly increased soil bacterial diversity. The richness index Chao1 was increased significantly at all growth stages, and the ACE index was significantly increased at the pre-sowing stage, flowering and boll stage and boll-opening stage.Compared to the blank control, the relative abundance of Actinobacteria was increased significantly at different growth stages after the return of broccoli residues to soil. Meanwhile, the results showed that there were differences in the composition of dominant microorganisms at different growth stages after the return of broccoli residues to soil. For example, Firmicutes increased to the dominant microflora at the pre-sowing stage and seedling stage, and Cyanobacteria became the dominant microflora at the bud stage and flowering and boll stage. Principal component analysis showed that broccoli residues to soil changed the structure of bacterial community at seedling stage, bud stage, flowering and boll stage and boll-opening stage. Further analysis showed that the relative abundance ofandwas significantly increased after the return of broccoli residues to soil.【Conclusion】Broccoli residues returning to soil can effectively inhibit the occurrence of cotton verticillium wilt, reduce the number of DNA copies ofin soil, change the structure of soil bacterial community, and increase the relative abundance of beneficial microorganisms, which is an effective green measure to control cotton verticillium wilt.

broccoli residues;; cotton verticillium wilt; bacterial community structure; Illumina MiSeq; growth stage

2019-06-03；

2019-06-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0200601）、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201503109）、國(guó)家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-15-17）

趙衛(wèi)松，Tel：0312-5927076；E-mail：zhaoweisong1985@163.com。通信作者馬平，Tel：0312-5915678；E-mail：pingma88@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）